發(fā)布時(shí)間：2020-03-22 14:56

【摘要】：目的:虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖鹽炙品、虎杖苷、虎杖蒽醌、熱炎寧合劑、熱炎寧合劑(不含虎杖)以小鼠可灌服最大濃度進(jìn)行灌胃給藥,觀察灌胃后藥物對(duì)小鼠的影響;運(yùn)用RTCA技術(shù)及HCA技術(shù)檢測(cè)虎杖經(jīng)過(guò)炮制后及配伍后是否具減毒作用;運(yùn)用RTCA技術(shù)及HCA技術(shù)檢測(cè)虎杖中虎杖苷以及虎杖蒽醌的毒性;使用倒置顯微鏡觀察對(duì)照孔、陽(yáng)性孔、虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖鹽炙品、虎杖苷、虎杖蒽醌、熱炎寧合劑、熱炎寧合劑(不含虎杖)作用于人正常肝細(xì)胞L-02 24h后對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。方法:虎杖炮炙品及熱炎寧合劑急性毒性實(shí)驗(yàn):取虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖鹽炙品、熱炎寧合劑、熱炎寧(不含虎杖)、虎杖苷、虎杖蒽醌8種藥物,以小鼠可灌服最大濃度進(jìn)行灌胃給藥,給藥體積0.4ml/10g,一天內(nèi)(間隔8小時(shí))給藥3次,連續(xù)14天觀察小鼠給藥后飲食、排泄等情況并計(jì)算LD_(50),最后進(jìn)行一般解剖尸檢,觀察各器官有無(wú)改變;肉眼觀察心臟、肺、胃、小腸、肝臟、腎臟及脾臟,對(duì)有變化的臟器需進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。RTCA檢測(cè)虎杖炮炙品及熱炎寧合劑對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02毒性實(shí)驗(yàn):用10%FBS DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液密度到6×10~4個(gè)/ml,于E-16plate中每孔加入100μl細(xì)胞懸液,大約24h后每孔加入相應(yīng)濃度藥物,對(duì)照孔加入10%FBS DMEM培養(yǎng)液,陽(yáng)性孔加入對(duì)1.25mg/ml乙酰氨基酚溶液,放回三氣培養(yǎng)箱連續(xù)檢測(cè)56小時(shí)。形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn):用10%FBS DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為6×10~4個(gè)/ml,于96孔板中每孔加入100μl人正常肝細(xì)胞L-02懸液,大約24h后每孔加入相應(yīng)濃度的藥物,對(duì)照孔加入DMEM培養(yǎng)液,陽(yáng)性孔加入1.25mg/ml對(duì)乙酰氨基酚溶液,放回三氣培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后,用無(wú)菌PBS溶液輕輕清洗每孔,然后在倒置顯微鏡10X物鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。HCA評(píng)價(jià)虎杖炮炙品及熱炎寧合劑對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02毒性實(shí)驗(yàn):用10%FBS DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液密度到6×10~4個(gè)/ml,96孔板中每孔加入100μl細(xì)胞懸液,大約24h后每孔加入相應(yīng)濃度藥物,對(duì)照孔加入10%FBS DMEM培養(yǎng)液,陽(yáng)性孔加入對(duì)1.25mg/ml乙酰氨基酚溶液,放回三氣培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)24h,吸棄藥液及培養(yǎng)基,加入探針?lè)跤?0min,上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果:虎杖及熱炎寧合劑急性毒性實(shí)驗(yàn):虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖鹽炙品、虎杖酒炙品、熱炎寧合劑、熱炎寧合劑(不含虎杖)、虎杖苷、虎杖蒽醌毒性較小,以小鼠可灌服的最大濃度以最大灌胃體積灌胃給藥,各組小鼠未出現(xiàn)死亡,每日積累最大耐受量(MTD)分別為799.2g/kg、944.4g/kg、968.4g/kg、912g/kg、817.2g/kg、558g/kg、75.6g/kg、96g/kg,各給藥組體重與空白組相比無(wú)顯著性差異。RTCA技術(shù)檢測(cè)虎杖炮炙品及熱炎寧合劑對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02的毒性實(shí)驗(yàn):虎杖生品與蒲公英、北敗醬、半枝蓮配伍的復(fù)方制劑熱炎寧合劑的毒性小于虎杖生品的毒性,熱炎寧的毒性大于熱炎寧(不含虎杖)的毒性,作用于人正常肝細(xì)胞L-02 24小時(shí),IC_(50)分別為13.08mg/ml、11.81mg/ml、13.32mg/ml,作用于人正常肝細(xì)胞L-02 48h,IC_(50)分別為12.44mg/ml、,11.97mg/ml、13.14mg/ml�；⒄冉�(jīng)過(guò)炮制后其毒性降低,醋炙品、酒炙品、鹽炙品作用人正常肝細(xì)胞L-02 24h,IC_(50)分別為12.15mg/ml、15.23mg/ml、31.26mg/ml;作用于人正常肝細(xì)L-02 48h,IC_(50)分別為12.00mg/ml、16.10mg/ml、69.97mg/ml。通過(guò)對(duì)比分析可以得出毒性大小:生品醋炙品酒炙品鹽炙品;虎杖苷與虎杖蒽醌作用于人正常肝細(xì)胞L-02 IC_(50)分別為,24h為263.05μg/ml、50.62mg/ml;48h為264.25μg/ml、52.81mg/ml。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:在倒置顯微鏡10X物鏡下觀察,與對(duì)照孔相比較,陽(yáng)性孔顯著抑制細(xì)胞的增殖,虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖鹽炙品、熱炎寧合劑(不含虎杖)、熱炎寧合劑、虎杖苷、虎杖蒽醌類(lèi)均呈現(xiàn)隨著藥物濃度增加細(xì)胞數(shù)量顯著減少,形態(tài)發(fā)生明顯變化。HCA評(píng)價(jià)虎杖炮炙品及熱炎寧合劑對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02毒性實(shí)驗(yàn):虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖鹽炙品、虎杖苷混懸液、虎杖蒽醌、熱炎寧合劑、熱炎寧合劑(不含虎杖)作用于人正常肝細(xì)胞24h,與陰性孔相比較,藥物作用后,細(xì)胞數(shù)目減少,線粒體膜電位降低、細(xì)胞面積變小,且具有梯度依賴(lài)性。結(jié)論:虎杖炮炙品及熱炎寧合劑無(wú)明顯急性毒性反應(yīng);虎杖經(jīng)過(guò)炮制和配伍后其毒性均降低。
【圖文】：

由 圖 1 可 知 ， 1×105個(gè) /ml、 8×104個(gè) /ml、 6×104個(gè) /ml、 4×104個(gè) /的人正常肝細(xì)胞 L-02 接種于 E-plate 16 檢測(cè)板中，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)檢測(cè)生長(zhǎng) 100h，觀察不同密度人正常肝細(xì)胞 L-02 生長(zhǎng)曲線。圖中橫坐標(biāo)數(shù)為時(shí)間，縱坐標(biāo)數(shù)值為 CI 值。CI 值越高代表細(xì)胞活性越高，由于細(xì)胞殖 的特點(diǎn)， 當(dāng)在孔中細(xì) 胞數(shù)目達(dá)到一定數(shù)量，即細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺(tái)期CI 值 也 不 再 增 加 。 密 度 在 1×105個(gè) /ml、 8×104個(gè) /ml 時(shí) ， 人 正 常 肝 細(xì)L-02 能夠快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，大約在 40 多個(gè)小時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期，，不能夠滿(mǎn)實(shí)驗(yàn)要求；密度為 4×104個(gè)/ml 時(shí)，L-02 人正常肝細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期較晚（值大于 0.5 認(rèn)為進(jìn)入對(duì)數(shù)期），因此選擇 6×104個(gè)/ml 作為最優(yōu)密度。4.2 RTCA 技術(shù)檢測(cè)虎杖生品、熱炎寧合劑、熱炎寧合劑（不含虎杖）人正常肝細(xì)胞 L-02 生長(zhǎng)的影響

由圖 2 可 知，運(yùn)用 RTCA 技術(shù)檢測(cè)不同濃度的虎杖生品對(duì)人正常肝細(xì)胞 L-02 增殖的影響。6×104個(gè)/ml 的人正常肝細(xì)胞 L-02 接種于 E-plate 1檢測(cè)板中 ，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè) 其生長(zhǎng)至約 24h，將 E-plate16 檢測(cè)板取出于超凈工作臺(tái)上，加入不同濃度的虎杖生品。再將 E-plate16 檢測(cè)板置于儀器上繼續(xù) 檢測(cè)約 56h，觀察虎杖生藥對(duì)人正常肝細(xì)胞 L-02 生長(zhǎng)的影響。圖中橫坐標(biāo)代表時(shí)間，縱坐標(biāo)代表 CI 值。CI 值越高代表細(xì)胞活性越高，由于 細(xì)胞增殖 的 特點(diǎn)，當(dāng)在孔 中細(xì)胞數(shù)目達(dá)到一定數(shù)量，即細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺(tái)期，CI 值也不再增加。實(shí) 驗(yàn)表 明 ：人 正 常肝 細(xì)胞 L-02 在 E-Plate 16 上 生長(zhǎng) 狀 態(tài)較 好 。與 對(duì)照組相比，陽(yáng)性組基本完全抑制人正常肝細(xì)胞 L-02 的增殖。與對(duì)照組相比 較 ， 虎 杖 生 品 不 同 的 濃 度 對(duì) 人 正 常 肝 細(xì) 胞 L-02 均 有 抑 制 作 用 ， 尤 以46.25mg/ml、23.13mg/ml 對(duì)人正常肝細(xì)胞 L-02 毒性作用最強(qiáng)，隨著濃度
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2595204