發(fā)布時(shí)間：2020-03-22 18:27

【摘要】：由感染、高熱所導(dǎo)致的小兒驚厥在臨床上十分普遍,長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)性的驚厥可能導(dǎo)致急性海馬損傷和海馬萎縮,進(jìn)而影響患者的認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶能力,可成為后期癲癇發(fā)生的基礎(chǔ)。針對(duì)熱性驚厥,目前臨床上以支持療法為主,對(duì)于持續(xù)狀態(tài)的驚厥,應(yīng)用抗癲癇藥物以增強(qiáng)γ-氨基丁酸的作用。然而,感染、高熱這兩個(gè)因素是如何協(xié)同地誘導(dǎo)驚厥,這兩個(gè)因素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng),特別是對(duì)海馬組織的突觸蛋白網(wǎng)絡(luò)會(huì)產(chǎn)生什么樣的改變?目前還不十分清楚。本研究欲建立大鼠腦組織突觸體的蛋白質(zhì)組學(xué)方法,并應(yīng)用該法研究高熱、感染因素對(duì)海馬突觸蛋白組的影響,尋找其導(dǎo)致驚厥的關(guān)鍵分子或通路;進(jìn)而研究對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛作用的人參對(duì)腦組織突觸蛋白組的影響,揭示人參防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的本質(zhì),試圖發(fā)現(xiàn)人參中對(duì)驚厥的發(fā)生有抑制作用的活性成分。第一部分 大鼠不同腦區(qū)突觸體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目的:建立大鼠腦組織突觸體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,并應(yīng)用該法研究大鼠額葉皮層、頂葉皮層、海馬體、紋狀體、嗅球和小腦皮層突觸體中的蛋白質(zhì)。方法:以Percoll為密度梯度介質(zhì)離心制備突觸體,并進(jìn)行電鏡觀察和蛋白印記驗(yàn)證;考察突觸體蛋白的提取方法,優(yōu)化還原烷基化及酶切過(guò)程,應(yīng)用納升液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)酶切后的肽段,根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)解析在突觸體中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)。結(jié)果:離心制備后,富集突觸體的部分在透射電鏡下可見(jiàn)多個(gè)結(jié)構(gòu)完整、形狀大小不一的突觸體,可以清晰地看到突觸后致密層、囊泡及線粒體,Western Blot檢測(cè)到了突觸前膜的特異性標(biāo)志物Synaptophysin及突觸后膜的特異性標(biāo)志物PSD 95。經(jīng)過(guò)考察,優(yōu)化的突觸體樣品前處理方法如下:以8 mol/L的尿素緩沖溶液為裂解液,提取后的蛋白經(jīng)過(guò)二硫蘇糖醇及碘乙酰胺的還原烷基化,再進(jìn)行胰酶及Lys-C酶的順序酶切。酶切后的肽段經(jīng)納升液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè),即可實(shí)現(xiàn)對(duì)突觸體蛋白質(zhì)的定性定量。應(yīng)用該法研究了大鼠不同腦區(qū)的突觸體蛋白質(zhì)組學(xué),兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)共同鑒定出了2920個(gè)蛋白質(zhì),包括突觸蛋白、突觸后致密層蛋白、線粒體蛋白、突觸囊泡蛋白、突觸前膜蛋白等;應(yīng)用不同的聚類(lèi)方法進(jìn)一步研究這些蛋白的分布規(guī)律,結(jié)合生物信息學(xué)知識(shí),發(fā)現(xiàn)在特定腦區(qū)的突觸體中表達(dá)相對(duì)較高的蛋白能夠代表其所在腦區(qū)的功能,證明了本部分所建立的突觸體蛋白質(zhì)組學(xué)方法的可行性。小結(jié):本部分建立了大鼠腦組織突觸體蛋白組學(xué)的方法,所得到的不同腦區(qū)突觸體蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)還可為其它研究提供數(shù)據(jù)支持與參考。第二部分 基于海馬的突觸體蛋白質(zhì)組學(xué)探究驚厥發(fā)生的分子機(jī)制目的:研究高熱、感染這兩種致驚厥因素對(duì)海馬突觸體蛋白表達(dá)的影響,揭示驚厥發(fā)生的分子機(jī)制。方法:應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究高熱、脂多糖(LPS)處理后動(dòng)物海馬突觸體蛋白表達(dá)譜的變化,結(jié)合生物信息學(xué)分析,尋找導(dǎo)致驚厥發(fā)生的分子機(jī)制,并應(yīng)用腦電記錄的方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:將LPS組和對(duì)照組相比發(fā)生顯著變化的蛋白,與高熱組和對(duì)照組相比發(fā)生顯著變化的蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)這兩種處理因素共同使1313個(gè)蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化,且其中的1312個(gè)蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)一致,說(shuō)明高熱和感染具有共同的作用基礎(chǔ),是二者可協(xié)同誘發(fā)驚厥的原因。通路分析及蛋白相互作用分析揭示谷氨酸能突觸通路在驚厥時(shí)發(fā)生了主要的改變,特別是以AMPA受體為核心的蛋白網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了明顯的改變(以上調(diào)為主),腦電記錄進(jìn)一步證明了AMPA受體的特異性抑制劑NBQX能夠抑制驚厥所導(dǎo)致的海馬癲癇樣放電,表明AMPA受體與感染和高熱導(dǎo)致的驚厥密切相關(guān)。小結(jié):LPS和高熱因素可使一些突觸蛋白發(fā)生趨勢(shì)一致的改變,且以AMPA受體為核心的蛋白網(wǎng)絡(luò)與感染和高熱導(dǎo)致的驚厥密切相關(guān)第三部分 基于突觸體蛋白質(zhì)組學(xué)研究人參對(duì)驚厥的防治作用目的:研究人參對(duì)腦組織突觸體蛋白的影響,揭示人參對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治的本質(zhì),找出人參發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ),并驗(yàn)證其對(duì)驚厥的抑制作用。方法:應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究大鼠長(zhǎng)期服用人參后海馬和皮層突觸體蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,并分析人參對(duì)線粒體氧化磷酸化通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;體外制備線粒體,應(yīng)用線粒體呼吸測(cè)定系統(tǒng)找出人參發(fā)揮作用的物質(zhì)成分;應(yīng)用腦電記錄的方法觀察人參皂苷對(duì)驚厥的抑制作用。結(jié)果:人參可以下調(diào)大鼠海馬和皮層突觸體中線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá),影響線粒體的氧化磷酸化過(guò)程;線粒體呼吸試驗(yàn)證實(shí)人參提取液及人參皂苷Rb1、Rg1、Rc、Rb2、Rd可以抑制皮層和海馬線粒體的氧化磷酸化過(guò)程,抑制ATP合酶活性,其中人參皂苷Rd作用最強(qiáng);應(yīng)用腦電記錄的方式證明人參皂苷Rd可以抑制驚厥所導(dǎo)致的海馬癲癇樣放電,達(dá)到腦保護(hù)的作用。小結(jié):人參主要影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體的氧化磷酸化過(guò)程,人參皂苷,特別是人參皂苷Rd是人參抑制線粒體氧化磷酸化的主要活性成分,人參皂苷Rd可以抑制驚厥所導(dǎo)致的海馬癲癇樣放電,可用來(lái)防治驚厥的發(fā)生。結(jié)論:1.建立了腦組織突觸體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法,通過(guò)研究不同腦區(qū)突觸體蛋白的表達(dá)證明了該方法的可行性,所得到的數(shù)據(jù)可為其它研究提供參考。2.感染和高熱均可改變海馬突觸體中的一些蛋白的表達(dá),可能是二者協(xié)同誘發(fā)驚厥的根本原因;而組學(xué)分析表明以AMPA受體為核心的蛋白網(wǎng)絡(luò)與感染和高熱導(dǎo)致的驚厥密切相關(guān)。3.人參提取液及部分人參皂苷可以抑制皮層和海馬線粒體的氧化磷酸化過(guò)程,抑制ATP合酶活性;人參皂苷Rd可以抑制驚厥所致的海馬癲癇樣放電。
【圖文】：

31圖 1-1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)解析的基本流程Fig. 1-1 The basic schemes for mass data acquisition and data analysis. TheMS2-based (A) and SPS-MS3-based (C) methods were shown in this figure.There are the protein identification scheme (B) and the protein simultaneousidentification and quantification scheme (D)

圖 1-2 突觸體的 Percoll 密度梯度分離圖aptosomes were separated by Percoll gradienlar fractions are generated, and synaptosomes
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 楊波;王靜;叢宇婷;胡良海;顧景凱;;基于蛋白質(zhì)組學(xué)的藥物代謝酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體定量分析研究進(jìn)展[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2015年06期

2 蘇萍;王蕾;杜仕靜;辛文鋒;張文生;;三七皂苷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥理作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)中藥雜志;2014年23期

3 王繼峰;趙新元;趙焱;馬成;鐘儒剛;錢(qián)小紅;應(yīng)萬(wàn)濤;;酶切過(guò)程中肽段過(guò)烷基化對(duì)蛋白質(zhì)定性和定量分析的影響[J];色譜;2013年10期

4 顧豐華;胡駿;陳嘉;劉翔;董文心;;分步離心和梯度離心制備大鼠腦突觸體方法的比較[J];中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志;2012年07期

5 盧國(guó)棟;張克山;劉永杰;尚佑軍;郭建宏;鄭海學(xué);田宏;劉湘濤;;蛋白質(zhì)組學(xué)樣品處理方法研究進(jìn)展[J];中國(guó)動(dòng)物檢疫;2011年06期

6 梁燕;闞紅衛(wèi);楊士友;;膜蛋白與膜蛋白組學(xué)[J];中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2009年11期

，

本文編號(hào)：2595440