發(fā)布時間：2020-03-22 18:27

【摘要】：由感染、高熱所導致的小兒驚厥在臨床上十分普遍,長時間反復性的驚厥可能導致急性海馬損傷和海馬萎縮,進而影響患者的認知、學習和記憶能力,可成為后期癲癇發(fā)生的基礎。針對熱性驚厥,目前臨床上以支持療法為主,對于持續(xù)狀態(tài)的驚厥,應用抗癲癇藥物以增強γ-氨基丁酸的作用。然而,感染、高熱這兩個因素是如何協(xié)同地誘導驚厥,這兩個因素對中樞神經(jīng)系統(tǒng),特別是對海馬組織的突觸蛋白網(wǎng)絡會產(chǎn)生什么樣的改變?目前還不十分清楚。本研究欲建立大鼠腦組織突觸體的蛋白質(zhì)組學方法,并應用該法研究高熱、感染因素對海馬突觸蛋白組的影響,尋找其導致驚厥的關鍵分子或通路;進而研究對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛作用的人參對腦組織突觸蛋白組的影響,揭示人參防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的本質(zhì),試圖發(fā)現(xiàn)人參中對驚厥的發(fā)生有抑制作用的活性成分。第一部分 大鼠不同腦區(qū)突觸體蛋白質(zhì)組學的研究目的:建立大鼠腦組織突觸體的蛋白質(zhì)組學研究方法,并應用該法研究大鼠額葉皮層、頂葉皮層、海馬體、紋狀體、嗅球和小腦皮層突觸體中的蛋白質(zhì)。方法:以Percoll為密度梯度介質(zhì)離心制備突觸體,并進行電鏡觀察和蛋白印記驗證;考察突觸體蛋白的提取方法,優(yōu)化還原烷基化及酶切過程,應用納升液相質(zhì)譜聯(lián)用技術檢測酶切后的肽段,根據(jù)數(shù)據(jù)庫解析在突觸體中檢測到的蛋白質(zhì)。結果:離心制備后,富集突觸體的部分在透射電鏡下可見多個結構完整、形狀大小不一的突觸體,可以清晰地看到突觸后致密層、囊泡及線粒體,Western Blot檢測到了突觸前膜的特異性標志物Synaptophysin及突觸后膜的特異性標志物PSD 95。經(jīng)過考察,優(yōu)化的突觸體樣品前處理方法如下:以8 mol/L的尿素緩沖溶液為裂解液,提取后的蛋白經(jīng)過二硫蘇糖醇及碘乙酰胺的還原烷基化,再進行胰酶及Lys-C酶的順序酶切。酶切后的肽段經(jīng)納升液相質(zhì)譜聯(lián)用技術檢測,即可實現(xiàn)對突觸體蛋白質(zhì)的定性定量。應用該法研究了大鼠不同腦區(qū)的突觸體蛋白質(zhì)組學,兩次重復實驗共同鑒定出了2920個蛋白質(zhì),包括突觸蛋白、突觸后致密層蛋白、線粒體蛋白、突觸囊泡蛋白、突觸前膜蛋白等;應用不同的聚類方法進一步研究這些蛋白的分布規(guī)律,結合生物信息學知識,發(fā)現(xiàn)在特定腦區(qū)的突觸體中表達相對較高的蛋白能夠代表其所在腦區(qū)的功能,證明了本部分所建立的突觸體蛋白質(zhì)組學方法的可行性。小結:本部分建立了大鼠腦組織突觸體蛋白組學的方法,所得到的不同腦區(qū)突觸體蛋白表達的數(shù)據(jù)還可為其它研究提供數(shù)據(jù)支持與參考。第二部分 基于海馬的突觸體蛋白質(zhì)組學探究驚厥發(fā)生的分子機制目的:研究高熱、感染這兩種致驚厥因素對海馬突觸體蛋白表達的影響,揭示驚厥發(fā)生的分子機制。方法:應用蛋白質(zhì)組學的方法研究高熱、脂多糖(LPS)處理后動物海馬突觸體蛋白表達譜的變化,結合生物信息學分析,尋找導致驚厥發(fā)生的分子機制,并應用腦電記錄的方法進行驗證。結果:將LPS組和對照組相比發(fā)生顯著變化的蛋白,與高熱組和對照組相比發(fā)生顯著變化的蛋白進行分析,發(fā)現(xiàn)這兩種處理因素共同使1313個蛋白的表達發(fā)生了變化,且其中的1312個蛋白表達的變化趨勢一致,說明高熱和感染具有共同的作用基礎,是二者可協(xié)同誘發(fā)驚厥的原因。通路分析及蛋白相互作用分析揭示谷氨酸能突觸通路在驚厥時發(fā)生了主要的改變,特別是以AMPA受體為核心的蛋白網(wǎng)絡發(fā)生了明顯的改變(以上調(diào)為主),腦電記錄進一步證明了AMPA受體的特異性抑制劑NBQX能夠抑制驚厥所導致的海馬癲癇樣放電,表明AMPA受體與感染和高熱導致的驚厥密切相關。小結:LPS和高熱因素可使一些突觸蛋白發(fā)生趨勢一致的改變,且以AMPA受體為核心的蛋白網(wǎng)絡與感染和高熱導致的驚厥密切相關第三部分 基于突觸體蛋白質(zhì)組學研究人參對驚厥的防治作用目的:研究人參對腦組織突觸體蛋白的影響,揭示人參對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治的本質(zhì),找出人參發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎,并驗證其對驚厥的抑制作用。方法:應用蛋白質(zhì)組學的方法研究大鼠長期服用人參后海馬和皮層突觸體蛋白質(zhì)表達的變化,并分析人參對線粒體氧化磷酸化通路相關蛋白表達的影響;體外制備線粒體,應用線粒體呼吸測定系統(tǒng)找出人參發(fā)揮作用的物質(zhì)成分;應用腦電記錄的方法觀察人參皂苷對驚厥的抑制作用。結果:人參可以下調(diào)大鼠海馬和皮層突觸體中線粒體相關蛋白的表達,影響線粒體的氧化磷酸化過程;線粒體呼吸試驗證實人參提取液及人參皂苷Rb1、Rg1、Rc、Rb2、Rd可以抑制皮層和海馬線粒體的氧化磷酸化過程,抑制ATP合酶活性,其中人參皂苷Rd作用最強;應用腦電記錄的方式證明人參皂苷Rd可以抑制驚厥所導致的海馬癲癇樣放電,達到腦保護的作用。小結:人參主要影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體的氧化磷酸化過程,人參皂苷,特別是人參皂苷Rd是人參抑制線粒體氧化磷酸化的主要活性成分,人參皂苷Rd可以抑制驚厥所導致的海馬癲癇樣放電,可用來防治驚厥的發(fā)生。結論:1.建立了腦組織突觸體蛋白質(zhì)組學的研究方法,通過研究不同腦區(qū)突觸體蛋白的表達證明了該方法的可行性,所得到的數(shù)據(jù)可為其它研究提供參考。2.感染和高熱均可改變海馬突觸體中的一些蛋白的表達,可能是二者協(xié)同誘發(fā)驚厥的根本原因;而組學分析表明以AMPA受體為核心的蛋白網(wǎng)絡與感染和高熱導致的驚厥密切相關。3.人參提取液及部分人參皂苷可以抑制皮層和海馬線粒體的氧化磷酸化過程,抑制ATP合酶活性;人參皂苷Rd可以抑制驚厥所致的海馬癲癇樣放電。
【圖文】：

31圖 1-1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)解析的基本流程Fig. 1-1 The basic schemes for mass data acquisition and data analysis. TheMS2-based (A) and SPS-MS3-based (C) methods were shown in this figure.There are the protein identification scheme (B) and the protein simultaneousidentification and quantification scheme (D)

圖 1-2 突觸體的 Percoll 密度梯度分離圖aptosomes were separated by Percoll gradienlar fractions are generated, and synaptosomes
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2595440