發(fā)布時(shí)間：2017-12-12 04:26

  本文關(guān)鍵詞：重組口蹄疫病毒VP1基因的布魯氏菌病活疫苗的構(gòu)建及其生物學(xué)活性研究

  更多相關(guān)文章： 布魯氏菌病 口蹄疫 VP1基因 wboA基因 疫苗

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,以下簡稱布病),是一種嚴(yán)重威脅人類健康的動(dòng)物源性人畜共患病。動(dòng)物感染后導(dǎo)致繁殖能力和生產(chǎn)性能下降,經(jīng)濟(jì)損失巨大。我國預(yù)防牛、羊布病主要使用的是布病活疫苗Brucella suis Stain 2株(B.suis S2株),該疫苗在使用過程中無法區(qū)分疫苗免疫與自然感染抗體,給該病的流行病學(xué)調(diào)查和臨床血清學(xué)診斷等造成了困難�？谔阋�(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的牛、羊等的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。VP1蛋白是FMDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,也是病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵,具有與細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn),所以VP1基因是研制基因工程疫苗的首選靶抗原。本研究以我國廣泛使用的布病活疫苗B.suis S2株為親本株,利用蔗糖自殺質(zhì)粒載體,將FMDV的VP1基因表達(dá)框部分替代了布魯氏菌wbo A基因,成功構(gòu)建了重組口蹄疫病毒VP1基因的布魯氏菌病活疫苗。首先,以布病活疫苗B.suis S2株基因組為模板,利用含氯霉素抗性載體分段缺失了wbo A基因,體外活力實(shí)驗(yàn)篩選了6個(gè)分段缺失重組菌的活力。然后,構(gòu)建了包含wbo A基因的上、下游同源臂、VP1基因表達(dá)框和蔗糖負(fù)篩選基因的重組穿梭質(zhì)粒p UC-wbo A-/VP1+,電轉(zhuǎn)化進(jìn)布病活疫苗B.suis S2株感受態(tài)細(xì)胞中,利用氨芐抗性基因(Amp+)和蔗糖負(fù)篩選基因(Sac B-)篩選得到陽性重組菌,經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定,命名為S2?wbo A/VP1株,進(jìn)一步開展重組疫苗的生物學(xué)特性研究,結(jié)果如下:(1)表型鑒定:熱凝集試驗(yàn)、吖啶黃試驗(yàn)和菌落結(jié)晶紫染色試驗(yàn)結(jié)果證明,重組疫苗S2?wbo A/VP1株的表型為粗糙型,表明親本株部分缺失了wbo A基因后布魯氏菌表型從光滑型改變?yōu)榇植谛汀?2)安全性評(píng)價(jià):以不同劑量的重組疫苗分別注射小鼠和牛,通過直腸測(cè)溫、采食情況和病理組織學(xué)觀察等結(jié)果均證明重組疫苗具有良好的安全性。(3)口蹄疫VP1基因的鑒定和體液免疫研究:將VP1基因進(jìn)行原核表達(dá),制備抗血清與重組疫苗進(jìn)行Western Blot分析,結(jié)果表明VP1在重組疫苗中成功表達(dá),具有免疫反應(yīng)原性。用地高辛探針標(biāo)記VP1基因進(jìn)行Southern雜交結(jié)果顯示,重組疫苗與親本株相比VP1基因已經(jīng)成功插入布魯氏菌基因組。間接ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí),與親本株不同,重組疫苗免疫組小鼠14d檢測(cè)到VP1基因抗體產(chǎn)生,第二次免疫后抗體水平呈快速增加趨勢(shì)。(4)布魯氏菌病免疫原性研究:重組疫苗的抗血清與不同表型布魯氏菌菌株的凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組疫苗與粗糙型菌株B.melitensis M111株和B.canine RM6/66株呈陽性反應(yīng),與其他光滑型菌株呈陰性反應(yīng)。以小鼠為動(dòng)物模型,通過脾臟稱重和細(xì)菌分離實(shí)驗(yàn)研究重組疫苗在小鼠體內(nèi)的存活時(shí)間。結(jié)果表明,免疫后14d重組疫苗小鼠脾臟重量高于親本株,與對(duì)照組差異顯著(P0.05)。免疫后42d,疫苗株幾乎不能引起小鼠脾臟腫大,與對(duì)照組差異不顯著(P0.05),脾臟中分離不到細(xì)菌。用微量試管凝集實(shí)驗(yàn)方法研究抗體消長規(guī)律,結(jié)果表明免疫后7d即可檢測(cè)到布魯氏菌抗體,從第7d~14d抗體顯著增加,第14d~28d抗體繼續(xù)增長,但趨勢(shì)緩慢,到第42d抗體呈降低趨勢(shì)。細(xì)胞因子檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果表明,重組疫苗與親本株免疫小鼠后產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)增長趨勢(shì)基本一致,免疫后第7d開始產(chǎn)生IFN-γ,第7d~28d IFN-γ值持續(xù)增加,28d后IFN-γ水平呈下降趨勢(shì)。小鼠攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組疫苗1×109CFU/只免疫組可以對(duì)羊種B.meltensis M28強(qiáng)毒株攻擊提供100%的保護(hù)。以羊?yàn)閯?dòng)物模型進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn),羊的脾臟和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)菌分離結(jié)果表明,1×1011 CFU/只免疫組感染強(qiáng)毒后有2/10只分離到強(qiáng)毒菌,免疫保護(hù)率為80%,與1×1010 CFU/只親本株提供相似的免疫保護(hù)率(80%)。由于布病和口蹄疫是兩種感染牛、羊的重要家畜傳染病,布魯氏菌疫苗作為載體能有效提供對(duì)目的基因編碼蛋白的細(xì)胞免疫作用。因此,本研究構(gòu)建并鑒定的重組口蹄疫VP1基因的布魯氏菌活疫苗為實(shí)現(xiàn)對(duì)布病和口蹄疫的雙重免疫提供候選疫苗株。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.4

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 賁百靈,孫廣力,婁永利;布魯氏菌病流行現(xiàn)狀和防治建議[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2005年07期

2 張艷紅;康建生;;山西省布魯氏菌病流行情況及防治對(duì)策[J];中國獸醫(yī)雜志;2008年09期

3 李秋麗;夏蔚;張彤;丁巖峰;;人畜布魯氏菌病流行特征的數(shù)據(jù)分析△[J];數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志;2008年05期

4 高慶田;;幾種布魯氏菌病診斷方法的比較[J];湖北畜牧獸醫(yī);2010年11期

5 白琨;張小書;;內(nèi)蒙古烏蘭察布市2010年布魯氏菌病疫情專項(xiàng)調(diào)查分析[J];當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè);2011年04期

6 趙鳳菊;;布魯氏菌病的流行情況及危害[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2011年02期

7 耿淑梅;;動(dòng)物布魯氏菌病的流行特點(diǎn)[J];養(yǎng)殖技術(shù)顧問;2011年09期

8 劉超;王向林;張仁富;;布魯氏菌病概述[J];中國畜牧業(yè);2013年13期

9 黃建中;;家禽布魯氏菌病——初步報(bào)告[J];地方病譯叢;1980年02期

10 金根源;;英國的人和牛的布魯氏菌病[J];地方病譯叢;1981年03期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周繼章;宮曉煒;曹小安;陳啟偉;鄭福英;費(fèi)媛媛;邱昌慶;;我國部分省(區(qū))動(dòng)物布魯氏菌病流行情況調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

2 周繼章;宮曉煒;曹小安;鄭福英;藺國珍;王光華;費(fèi)媛媛;邱昌慶;;2009-2010年我國部分省(區(qū))動(dòng)物布魯氏菌病流行情況調(diào)查[A];第3屆全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

3 牛金星;任德新;張鑫榮;;灘羊布魯氏菌病的檢測(cè)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)羊?qū)W分會(huì)2014年全國養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì)議論文集[C];2014年

4 杜美蘭;羅秋菊;崔宏偉;賈少菊;;布魯氏菌病的健康宣教[A];中華護(hù)理學(xué)會(huì)2009全國傳染病護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會(huì)議論文匯編[C];2009年

5 毛開榮;;布魯氏菌病研究進(jìn)展[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

6 劉東立;;抗菌素聯(lián)合用藥治療布魯氏菌病效果觀察[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

7 朱匡紀(jì);蔡祖華;邵豐堯;黃秀琴;王菊叢;樓妙芬;;2005年婺城區(qū)布魯氏菌病國家級(jí)監(jiān)測(cè)點(diǎn)監(jiān)測(cè)報(bào)告[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

8 葉麗萍;許國章;魯鋒;孫亞維;張吉楠;董紅軍;;2002～2005年寧波市職業(yè)重點(diǎn)人群布魯氏菌病監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

9 蔣軼文;白羽;;職業(yè)性布魯氏菌病研究進(jìn)展[A];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)第十八次全國職業(yè)病學(xué)術(shù)交流大會(huì)論文匯編[C];2009年

10 鄭源強(qiáng);吳巖;畢力夫;;布魯氏菌病檢測(cè)、防控措施與疫苗研究進(jìn)展[A];2011新型疫苗與抗體創(chuàng)制關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量控制研討會(huì)論文集[C];2011年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 韋良俊;我區(qū)須加強(qiáng)防控布魯氏菌病[N];阿勒泰日?qǐng)?bào);2008年

2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 邱昌慶 研究員;對(duì)奶牛布魯氏菌病防制的思考[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2005年

3 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 邱昌慶研究員;對(duì)奶牛布魯氏菌病防制的思考[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2005年

4 劉朝江;預(yù)防人畜共染布魯氏菌病[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2014年

5 中國獸藥監(jiān)察所 副研究員 毛開榮;羊布魯氏菌病的防治[N];中國畜牧水產(chǎn)報(bào);2000年

6 記者 蔣中意;我市被衛(wèi)生部定為布魯氏菌病檢測(cè)點(diǎn)[N];金華日?qǐng)?bào);2005年

7 施水泉邋記者 李水根;確診布魯氏菌病有了“快槍手”[N];健康報(bào);2007年

8 記者 馬艷軍;落實(shí)五項(xiàng)措施 控制布魯氏菌病疫情[N];內(nèi)蒙古日?qǐng)?bào)(漢);2006年

9 記者 陳艷陽邋通訊員 衣曉峰 時(shí)長山;布魯氏菌病疫情上升值得警惕[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2007年

10 張建平;加強(qiáng)布魯氏菌病的防治[N];河北經(jīng)濟(jì)日?qǐng)?bào);2008年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 殷德輝;基于多表位融合蛋白的人布魯氏菌病檢測(cè)技術(shù)研究[D];吉林大學(xué);2016年

2 王楠;重組口蹄疫病毒VP1基因的布魯氏菌病活疫苗的構(gòu)建及其生物學(xué)活性研究[D];吉林大學(xué);2016年

3 李向陽;內(nèi)蒙古通遼地區(qū)奶牛布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查和感染機(jī)理初步分析[D];吉林大學(xué);2013年

4 甄清;人布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)化PCR診斷方法及BP26基因標(biāo)記疫苗研究[D];吉林大學(xué);2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李秋麗;利用統(tǒng)計(jì)方法分析某地區(qū)布魯氏菌病的流行特征[D];東北師范大學(xué);2007年

2 黎銀軍;我國布魯氏菌病時(shí)空分布及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2013年

3 郝博;一些具有間接傳染的布魯氏菌病動(dòng)力學(xué)模型及其穩(wěn)定性分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

4 武燕;靖邊縣奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病檢測(cè)與分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

5 束鴻鵬;布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)方法比較和云南陸良奶山羊布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 何宗霖;阿克蘇地區(qū)家畜布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查及防控對(duì)策[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 楊志光;中國布魯氏菌病疫情形勢(shì)及防治對(duì)策[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2010年

8 韓丹;新疆布魯氏菌病患者外周血T細(xì)胞亞群的臨床分析[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2016年

9 王銳澤;2009~2012年吉林省松原市布魯氏菌病門診就診人群流行病學(xué)特征分析[D];吉林大學(xué);2016年

10 韋明;規(guī)�；�牧場布魯氏菌病血清學(xué)調(diào)查與iELISA檢測(cè)方法的建立[D];寧夏大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：1281177