發(fā)布時(shí)間：2018-04-11 11:30

  本文選題：水稻 + 免疫應(yīng)答��； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻T51-1 (Tu et al.,2000)是一個(gè)結(jié)實(shí)率偏低和葉尖枯萎且葉色發(fā)黃的插入突變體,其旁側(cè)序列分析證實(shí)該插入突變體中的外源Bt基因是插入在一個(gè)水稻內(nèi)源類抗病基因Os10g0183000的啟動(dòng)子中,并位于該基因起始.密碼子ATG上游797bp處(Lai et al.,2013)。由于T51-1相對(duì)原始非轉(zhuǎn)基因受體親本明恢63(MH63)最顯著的特征是低結(jié)實(shí)率,因此將該基因命名為OsLSR(Low seed setting rate)。本研究以MH63為材料克隆了該基因,通過反向遺傳學(xué)對(duì)OsLSR在水稻中的功能進(jìn)行了分析和驗(yàn)證,著重分析了該基因的表達(dá)特性,基因及其各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能,亞細(xì)胞定位和積累特性,以及蛋白質(zhì)互作和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。研究結(jié)果如下：(一) OsLSR的表達(dá)特性：實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)OsLSR在水稻各個(gè)組織包括根,莖,葉,葉鞘,節(jié),花中都有表達(dá),且在水稻小花內(nèi)部器官包括雌蕊,雄蕊,漿片中表達(dá)水平較高。將OsLSR的啟動(dòng)子連接GUS報(bào)告基因,進(jìn)一步分析了該基因在水稻花序發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)特性,發(fā)現(xiàn)其在水稻花發(fā)育過程中的表達(dá)涉及每一個(gè)器官而且具有明顯的時(shí)序特點(diǎn)：起先只在小花枝梗分叉處表達(dá)；繼而在雌蕊底部大量表達(dá)直至開花；隨著花器官的發(fā)育,在早期幼嫩花藥中高效表達(dá),然后逐漸減弱消失；開花前,在花絲中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)并達(dá)到峰值水平；臨開花時(shí)則在漿片中大量表達(dá)。OsLSR的這種表達(dá)特性,表明OsLSR在水稻花器官發(fā)育和開花過程中,扮演著非常重要的角色。(二) OsLSR在水稻中的功能：序列比對(duì)表明,OsLSR基因具有植物NLR基因的典型特征；熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)T51-1中OsLSR的表達(dá)量被上調(diào),且所檢測(cè)的免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)量也出現(xiàn)了1.7-158倍不同程度的上升；將OsLSR在煙草中瞬時(shí)表達(dá),誘導(dǎo)煙草細(xì)胞產(chǎn)生超敏反應(yīng)；在水稻品種明恢63穩(wěn)定過量表達(dá)OsLSR,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)弱勢(shì),且結(jié)實(shí)率顯著下降；這些結(jié)果證實(shí)OsLSR基因編碼細(xì)胞內(nèi)免疫受體NLR蛋白,而T51-1生長(zhǎng)弱勢(shì)是由于OsLSR基因表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致植株長(zhǎng)期處于免疫激活狀態(tài)所致。當(dāng)利用RNAi技術(shù)抑制該基因的表達(dá)后,陽性愈傷的根系再生和生長(zhǎng)受阻,且形態(tài)發(fā)生異常；至生殖生長(zhǎng)階段,部分分生組織確定性消失以致花器官分化發(fā)生紊亂；進(jìn)一步通過過量表達(dá)OsLSR蛋白的不同功能域或片段,轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出不同程度的花發(fā)育缺陷；然而將OsLSR全長(zhǎng)蛋白與核定位信號(hào)NLS和輸出信號(hào)NES融合以改變其在水稻細(xì)胞中的原有分布狀態(tài),同樣能引起花器官分化異常。這些結(jié)果因而進(jìn)一步表明OsLSR基因參與了花器官的發(fā)育與分化。由此看來,OsLSR是一個(gè)既參與了水稻免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)又參與了其花器官發(fā)育與分化的基因。這是首次報(bào)道NLR蛋白影響水稻花器官建成的直接證據(jù),因此增進(jìn)了人們對(duì)NLR類基因功能的認(rèn)識(shí)。(三) OsLSR的亞細(xì)胞分布和免疫應(yīng)答模式：前人的研究業(yè)已表明植物NLR蛋白的亞細(xì)胞分布對(duì)其行使功能有著重要的影響。對(duì)此采用兩種方法對(duì)OsLSR的亞細(xì)胞分布進(jìn)行了研究。由于OsLSR蛋白的致死性,無法通過在煙草細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)中來得到完整OsLSR蛋白的亞細(xì)胞分布。于是通過構(gòu)建一系列OsLSR結(jié)構(gòu)域截段和eGFPde融合表達(dá)載體,來研究它的亞細(xì)胞分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LSR 1-178和LSR464-546兩個(gè)截段的eGFP融合蛋白均表現(xiàn)出依賴蛋白豐度的細(xì)胞分布特性,即在低豐度的細(xì)胞中,均定位于葉綠體中,而在高豐度表達(dá)的細(xì)胞中,前者表現(xiàn)為在葉綠體、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布,而后者則只在細(xì)胞質(zhì)中積累。聯(lián)系到OsLSR蛋白的豐度與它的免疫激活程度有關(guān),可以推斷,OsLSR低豐度表達(dá)時(shí),不被激活的OsLSR蛋白位于葉綠體中；但當(dāng)OsLSR表達(dá)增加,OsLSR蛋白被激活,并隨即從葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。進(jìn)一步地,我們通過引入外源的核定位信號(hào)NLS和核輸出信號(hào)NES來改變OsLSR在核內(nèi)外的分布,以了解對(duì)其生物學(xué)功能有無影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)時(shí),由于亞細(xì)胞積累特性的改變導(dǎo)致OsLSR誘導(dǎo)過敏性細(xì)胞死亡的能力減弱和NtPR1a表達(dá)水平降低；而在水稻中穩(wěn)定表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)引入核定位信號(hào)NLS的轉(zhuǎn)基因植株中的抗性標(biāo)記基因的表達(dá)均高于引入核輸出信號(hào)NES的轉(zhuǎn)基因植株。另外,通過分析內(nèi)源OsLSR的轉(zhuǎn)錄水平,我們還發(fā)現(xiàn)LSR::eGFPHLS能充分抑制其轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果因此說明細(xì)胞核內(nèi)的OsLSR具有自身負(fù)反饋調(diào)解能力。由此看來,細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中積累的OsLSR都參與了免疫應(yīng)答信號(hào)傳遞,其中細(xì)胞核中積累的OsLSR對(duì)于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答時(shí)的轉(zhuǎn)錄重編程至關(guān)重要,并對(duì)自身表達(dá)具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,以免過于激烈的自免疫反應(yīng)造成自我傷害。(四) OsLSR對(duì)下游基因的調(diào)控特性：以LSR1-178為誘餌蛋白,通過酵母雙雜交篩選水稻cDNA文庫,發(fā)現(xiàn)其與水稻亞硫酸鹽氧化酶OsSO,和金屬硫蛋白OsMT2b存在互作。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)它們?cè)趏SLSR于擾和過表達(dá)株系中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)oSLSR對(duì)這兩個(gè)基因均是負(fù)調(diào)控。在oSLSR結(jié)構(gòu)域超表植株中發(fā)現(xiàn)LSR1-178負(fù)責(zé)抑制作用,而LSR160-437和LSR464-894則促進(jìn)了它們的表達(dá)。這與文獻(xiàn)報(bào)道的osSO和oSMT2b參與了植物的抗病以及細(xì)胞死亡結(jié)果相一致,并且這兩個(gè)基因表達(dá)異常均能阻礙水稻的生長(zhǎng)發(fā)育。這些研究結(jié)果表明,oSLSR除了能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和調(diào)控水稻小花分化外,還能通過調(diào)控oSMT2b和osSO的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,使得它們保持一個(gè)正常的轉(zhuǎn)錄水平,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。綜上所述,本項(xiàng)研究以T51-1及其受體親本MH63為材料,闡明了水稻基因osLSR對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病害的作用及機(jī)理,解釋了T51-1的生長(zhǎng)弱勢(shì)的原因。本項(xiàng)研究將水稻免疫應(yīng)答和小花分化這兩個(gè)過去被認(rèn)為是相互獨(dú)立的生理生化過程,通過osLSR在分子水平上建立了聯(lián)系,拓寬了對(duì)NB-LRR蛋白功能的認(rèn)知,為進(jìn)一步交叉研究提供了新的啟發(fā)和思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S511

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