發(fā)布時(shí)間：2020-10-27 05:34

　　 研究背景 石棉是自然界存在的纖維狀物質(zhì),具有保溫、隔熱、絕緣和隔音等性能。石棉作為工業(yè)原料和材料己有數(shù)千年的歷史,目前石棉相關(guān)制品有3000多種,主要應(yīng)用于汽車、化工和電器設(shè)備等工業(yè)部門。盡管石棉在工業(yè)發(fā)展中有重要作用,但是長(zhǎng)期接觸石棉可引起肺部組織纖維化,甚至誘發(fā)支氣管肺癌和間皮瘤。石棉共分兩大類：溫石棉(Chrysotile Fibers, CF)和角閃石類石棉,在所有的石棉中,致病能力最強(qiáng)的是角閃石棉中的青石棉[21,但對(duì)于溫石棉是否具有致癌、致纖維化的能力,還有爭(zhēng)議。我國(guó)的政策是禁止使用角閃石石棉,安全使用溫石棉。由于石棉具有致癌性,出現(xiàn)了人工合成的石棉替代品,稱人造礦物纖維(Man-Made Mineral Fibers, MMMF),也稱人造玻璃纖維(Man-Made Vitreous Fibers, MMVF),常用的品種有：玻璃棉(Glass Wool, GW)、巖棉(Rock Wool, RW)和渣棉(Slag Wool),耐火陶瓷纖維(Refractory Ceramic Fiber, RCF)等。然而有研究表明,石棉替代品同樣具有生物活性和致病的可能性,其致病機(jī)理和分子機(jī)制目前尚在研究之中。 溫石棉及替代品的體外實(shí)驗(yàn)可以提供對(duì)人體的生物危害及其分子機(jī)制等信息。無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redoxfactor-1, APE/Ref-1)是一種具有DNA修復(fù)、氧化還原以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性的多功能蛋白；多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1)是DNA損傷感應(yīng)及監(jiān)測(cè)分子,其參與許多重要的生命活動(dòng)如凋亡、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細(xì)胞死亡等。 本項(xiàng)研究通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法,研究RCF1、 GW1、RW1和CF致人支氣管上皮細(xì)胞(Human Bronchial Epithelial Cells, BEAS-2B)和人胸膜間皮細(xì)胞(Human Pleural Mesothelial Cells, Met-5A)損傷的作用,為探尋纖維誘發(fā)細(xì)胞病變的機(jī)理提供依據(jù)。本課題應(yīng)用RNA干擾技術(shù)建立PARP-1和APE/Ref-1基因缺陷細(xì)胞株,為闡明RCF1、GW1、RW1和CF引起細(xì)胞毒性的分子機(jī)理提供細(xì)胞工具。 研究目的 評(píng)估RCF1、GW1、RW1和CF對(duì)BEAS-2B和Met-5A細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。評(píng)估APE/Ref-1的PARP-1在受試?yán)w維刺激BEAS-2B和Met-5A細(xì)胞中的作用。 研究方法 1.體外培養(yǎng)Met-5A和BEAS-2B細(xì)胞,用RCF1、GW1、RW1和CF刺激細(xì)胞不同時(shí)間后,采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力的大小,彗星試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷程度和DNA損傷修復(fù)能力,流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞的凋亡率,熒光探針DHR123和DCFH-DA測(cè)細(xì)胞內(nèi)(Reactive Oxygen Species, ROS)水平,掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,用NAC預(yù)處理細(xì)胞2h再用受試?yán)w維刺激細(xì)胞24h,觀察纖維對(duì)細(xì)胞DNA損傷、凋亡的影響。 2.20μg/cm2纖維刺激細(xì)胞后,用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)caspase-3、caspase-9、 APE/Ref-1和PARP-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。 3.利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建PARP-1缺陷和APE/Ref-1缺陷的Met-5A和BEAS-2B細(xì)胞系。 4.沉默APE/Ref-1和PARP-1后,觀察纖維對(duì)基因缺陷細(xì)胞的凋亡和DNA損傷的影響。 結(jié)果 1. BEAS-2B和Met-5A細(xì)胞分別暴露于濃度為5至200μg/cm2的RCF1、GW1、RW1和CF纖維24h、48h和72h后發(fā)現(xiàn),在低劑量(5μg/cm2)時(shí)有刺激細(xì)胞增殖的現(xiàn)象,在高劑量(20、40、100和200μg/cm2)時(shí),細(xì)胞活力下降有明顯的劑量和時(shí)間反應(yīng)關(guān)系。 2.掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),暴露于20μg/cm2纖維的細(xì)胞出現(xiàn)微絨毛損失、吞噬等現(xiàn)象。 3.細(xì)胞暴露于0～20μg/cm2纖維4h、24h和48h后,DNA損傷表現(xiàn)為時(shí)間依賴性和劑量依賴性增加(P0.05)。去除纖維刺激3小時(shí)后,細(xì)胞的DNA損傷可修復(fù)。NAC對(duì)細(xì)胞DNA損傷有拮抗作用。 4.分別用RCF1、RW1、GW1和CF刺激細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率增高,而GW1刺激細(xì)胞凋亡率小于其它纖維。RCF1、GW1、RW1和CF刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS的熒強(qiáng)度明顯大于空白組。NAC對(duì)細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)生有抑制作用。 5.分別用RCF1、GW1、RW1和CF刺激BEAS-2B和Met-5A細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)caspase-3和caspase-9的mRNA和蛋白水平隨著時(shí)間的增加而增加。APE/Ref-1和PARP-1的mRNA和蛋白水平隨著時(shí)間的增加先增高而后下降。 6.本研究利用RNAi技術(shù)分別構(gòu)建了Met-5A和BEAS-2B細(xì)胞的PARP-1基因缺陷細(xì)胞株和APE/Ref-1基因缺陷細(xì)胞株,基因缺陷細(xì)胞株與正常細(xì)胞株相比,mRNA表達(dá)水平下降了70～80%,蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降了80%以上,沉默效果顯著且穩(wěn)定性好。 7.分別用受試?yán)w維刺激基因缺陷細(xì)胞和正常細(xì)胞,基因缺陷細(xì)胞的DNA損傷和細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)高于正常細(xì)胞。 結(jié)論： 1. RCF1、GW1、RW1和CF可誘導(dǎo)BEAS-2B和Met-5A細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡,ROS在其中起至關(guān)重要作用。 2. Caspase-3和caspases-9參與RCF1、GW1、RW1和CF誘導(dǎo)BEAS-2B和Met-5A細(xì)胞的凋亡過(guò)程。 3. PARP-1和APE/Ref-1缺陷可加重RCF1、GW1、RW1和CF對(duì)Met-5A和BEAS-2B細(xì)胞的DNA損傷程度和細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)。PARP-1和APE/Ref-1在RCF1、GW1、RW1和CF引起的細(xì)胞損傷中有重要作用。 4.本研究用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了PARP-1和APE/Ref-1基因缺陷細(xì)胞株,沉默效果顯著且穩(wěn)定性好,為后續(xù)基因功能研究提供了有效的工具細(xì)胞。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R131
【文章目錄】：
致謝
中文摘要
Abstract
英文縮略語(yǔ)
目錄
第一部分 溫石棉及其替代品致Met-5A細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞的毒性作用
    1.1 引言
    1.2. 材料與方法
        1.2.1 主要材料
        1.2.2 主要試劑
        1.2.3 溶液配制
        1.2.4 儀器設(shè)備
        1.2.5 實(shí)驗(yàn)方法與內(nèi)容
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 RCF1、GW1、RW1和CF刺激后BEAS-2B和Met-5A細(xì)胞的活力
        1.3.2 RCF1、GW1、RW1和CF致BEAS-2B細(xì)胞和Met-5A細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變
        1.3.3 RCF1、GW1、RW1和CF致BEAS-2B細(xì)胞和Met-5A細(xì)胞DNA的損傷
        1.3.4 YO-PRO-1和PI聯(lián)合染色定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        1.3.5 熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生
        1.3.6 DHR123檢測(cè)細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平
        1.3.7 PARP-1、APE/Ref-1、caspase-3和caspase-9基因mRNA表達(dá)水平
        1.3.8 PARP-1、APE/Ref-1、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平
        1.3.9 抗氧化劑NAC對(duì)細(xì)胞DNA損傷、凋亡和ROS的抑制作用
    1.4 討論
第二部分 PARP-1和APE/Ref-1缺陷細(xì)胞株的構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 主要材料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    2.3 研究結(jié)果
        2.3.1 質(zhì)粒陽(yáng)性克隆鑒定
        2.3.2 慢病毒滴度測(cè)定
        2.3.3 目的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率
        2.3.4 PARP-1敲除和APE/Ref-1敲除慢病毒載體效能鑒定
    2.4 討論
第三部分 PARP-1和APE/Ref-1抑制在溫石棉及其替代品致細(xì)胞損傷中的作用
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
    3.3 研究結(jié)果
        3.3.1 細(xì)胞活力測(cè)定
        3.3.2 PARP-1和APE/Ref-1在溫石棉及替代品致細(xì)胞凋亡中的作用
        3.3.3 PARP-1和APE/Ref-1在溫石棉及替代品致細(xì)胞DNA損傷中作用
    3.4 討論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)歷及在讀期間所取得的科研成果

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本文編號(hào)：2858119