發(fā)布時間：2018-01-05 06:21

  本文關(guān)鍵詞：穴位埋線對衰老模型大鼠海馬自噬的影響　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)三個環(huán)節(jié),通過觀察大鼠一般狀態(tài)、體重、曠場實(shí)驗(yàn)、水迷宮定位航行試驗(yàn)及空間探索試驗(yàn),海馬神經(jīng)元HE染色、海馬神經(jīng)元尼氏染色、海馬神經(jīng)元透射電鏡超微結(jié)構(gòu),海馬神經(jīng)元mTOR信號通路中ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62mRNA 以及p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 蛋白等指標(biāo),從自噬角度闡明衰老的機(jī)制及慢性應(yīng)激促進(jìn)衰老的機(jī)理,為延緩衰老提供新的思路和理論依據(jù);基于mTOR信號通路闡明穴位埋線影響復(fù)合衰老模型大鼠海馬自噬功能的機(jī)制,為中醫(yī)藥延緩衰老的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:按照體重排序,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為組空白對照、模型一組(D-半乳糖腹腔注射)、模型二組(復(fù)合衰老模型)、穴位埋線組、假埋線組,每組12只�？瞻讓φ战M僅給予6周腹腔注射生理鹽水。模型一組僅給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d)。模型二組給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d),同時從第3周開始給予慢性應(yīng)激,共應(yīng)激4周。穴位埋線組給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d),同時從第3周開始給予慢性應(yīng)激,應(yīng)激方式同模型二組,共應(yīng)激4周。從第一周開始,每周埋線一次,共6次。假埋線組組給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d),同時從第3周開始給予慢性應(yīng)激,應(yīng)激方式同模型二組,共應(yīng)激4周。從第一周開始,每周假埋線一次,共6次。埋線處方:選取"腎俞(雙)"、"足三里(雙)"、"百會"、"太沖(雙)"作為穴位埋線處方。"腎俞(雙)"、"百會(雙)" 一組,"太沖"和"足三里(雙)" 一組,兩組交替埋線。實(shí)驗(yàn)過程中,觀察大鼠毛發(fā)飲食精神活動情況等一般狀態(tài)。于實(shí)驗(yàn)前、3周后、實(shí)驗(yàn)結(jié)束(6周)后稱量各組大鼠的體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)--反映衰老大鼠自主活動能力的曠場實(shí)驗(yàn)及反映學(xué)習(xí)認(rèn)知記憶能力的水迷宮實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)結(jié)束后立馬取材,通過HE染色及尼氏染色檢測觀察大鼠海馬的一般病理形態(tài)結(jié)構(gòu);通過電鏡檢測觀察海馬的超微結(jié)構(gòu);qPCR法檢測海馬中ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA的表達(dá);蛋白印記法(westernblot)檢測海馬中p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.各組大鼠一般狀態(tài)改變模型一組、模型二組、假埋線組大鼠經(jīng)過造模后,毛發(fā)凌亂晦暗、反應(yīng)遲鈍、精神倦怠少動、飲食量減少、耳廓無光澤,且模型二組、假埋線組老化現(xiàn)象更明顯。穴位埋線組的老化現(xiàn)象得到明顯改善。2.各組大鼠體重結(jié)果在造模期間,各組大鼠體重均有增長�？瞻讓φ战M及模型一組的體重增長速度最快,穴位埋線組大鼠的體重增長較空白對照組緩慢,模型二組及假埋線組大鼠體重增長最慢。3.各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對照組相比,模型一組、模型二組、假埋線組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)活躍度、中央?yún)^(qū)路程、中央?yún)^(qū)時間、總路程均減少(P0.05),且模型二組及假埋線組較模型一組有升高或升高趨勢。與模型二組相比,穴位埋線組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)活躍度、中央?yún)^(qū)路程、中央?yún)^(qū)時間、總路程均增加(P0.05)4.各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過四天的定位航行試驗(yàn)訓(xùn)練,各組大鼠的逃避潛伏期均明顯減少,其中空白對照組及穴位埋線組變化趨勢最明顯,模型一組次之,模型二組及假埋線組大鼠逃避潛伏期變化趨勢最緩慢。在定位航行試驗(yàn)第四天,各組大鼠逃避潛伏期顯示明顯差異,與空白對照組相比,模型二組及假埋線組大鼠逃避潛伏期均升高(P0.05),模型一組逃避潛伏期有升高趨勢(P0.05);與模型一組相比,模型二組及假埋線組逃避潛伏期有升高趨勢(P0.05);與模型二組相比,穴位埋線組大鼠逃避潛伏期降低(P0.05);與穴位埋線組相比,假埋線組大鼠逃避潛伏期升高(P0.01)。與空白對照組相比,模型一組、模型二組及假埋線組穿越平臺次數(shù)減少(P0.05);穴位埋線組穿越平臺次數(shù)較之模型一組、模型二組及假埋線組有升高趨勢(P0.05);模型一組、模型二組及假埋線組三組之間穿越平臺次數(shù)進(jìn)行兩兩比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.各組大鼠海馬HE染色結(jié)果空白對照鼠海馬區(qū)神經(jīng)元豐富,結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞排列整齊緊密。模型一組、模型二組、假埋線組海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少,排列紊亂,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞萎縮,且模型二組、假埋線組的病變程度比模型一組嚴(yán)重。穴位埋線組海馬區(qū)神經(jīng)元排列稍疏松,尚整齊,少量神經(jīng)元萎縮,細(xì)胞數(shù)量無明顯減少。6.各組大鼠海馬尼氏染色結(jié)果空白對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常尼氏體清晰、豐富。模型一組、模型二組、假埋線組大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂,細(xì)胞間隙增大,尼氏體減少,且模型二組、假埋線組的病變程度比模型一組嚴(yán)重,尼氏體減少甚至消失。穴位埋線組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列還算整齊,但輕度疏松,細(xì)胞間隙稍增大,尼氏體清晰。7.各組大鼠海馬電鏡超微結(jié)構(gòu)結(jié)果空白對照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)均正常有自噬小體的存在;未觀察到脂褐素;突觸體數(shù)量多且大,微管結(jié)構(gòu)豐富。模型一組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核異形,線粒體數(shù)量減少、腫脹變性;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂,甚至出現(xiàn)脫顆粒現(xiàn)象;自噬小體數(shù)量較之空白對照組明顯增多;突觸體數(shù)量減少,體積縮小,樹突內(nèi)微管和微絲結(jié)構(gòu)存在溶解現(xiàn)象;脂褐素沉積增多。模型二組及假埋線組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷均較模型一組嚴(yán)重,自噬小體增多。穴位埋線組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)大致正常,細(xì)胞核呈圓形,核膜完整,核仁明顯,染色質(zhì)數(shù)量多且分布均勻;線粒體數(shù)量尚可,偶有線粒體嵴不規(guī)則甚至消失,無空泡樣變性;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶有脫顆�，F(xiàn)象;可見自噬小體;突觸體結(jié)構(gòu)數(shù)量基本正常,樹突中微管微絲結(jié)構(gòu)大致正常8.各組大鼠海馬ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62mRNA的表達(dá)結(jié)果與空白對照組相比,模型一組海馬LC3-Ⅱ、P62mRNA表達(dá)升高(P0.05),ULK1、Beclin1mRNA 的表達(dá)有升高趨勢(P0.05);模型二組 ULK1、LC3-Ⅱ、P62mRNA表達(dá)升高(P0.05),Beclin1 mRNA的表達(dá)有升高趨勢(P0.05)。與模型一組相比,模型二組海馬 LC3-Ⅱ mRNA、P62 mRNA 表達(dá)升高(P0.05),ULK1、Beclin1 mRNA的表達(dá)有升高趨勢(P0.05)。與模型二組相比,穴位埋線組海馬ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA表達(dá)均降低(P0.01)。與穴位埋線組相比,假埋線組海馬ULK1、Beclin1mRNA、LC3-Ⅱ、P62mRNA 表達(dá)升高(P0.05)。9.各組大鼠海馬p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)結(jié)果與空白對照組相比,模型一組大鼠海馬神經(jīng)元P62、Beclin1蛋白的表達(dá)有升高趨勢(P0.05),LC3-Ⅱ、ULK1 蛋白表達(dá)升高(P0.05),p-mTOR 表達(dá)降低(P0.01);模型二組LC3-Ⅱ、P62、ULK1、Beclin1蛋白表達(dá)均升高(P0.05),p-mTOR表達(dá)降低(P0.01)。與模型一組相比,模型二組大鼠海馬神經(jīng)元ULK1、P62、Beclin1、P62蛋白表達(dá)升高(P0.05),p-mTOR蛋白的表達(dá)有降低趨勢(P0.05)。與模型二組相比,穴位埋線組大鼠海馬神經(jīng)元ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)均降低(P0.05),p-mTOR表達(dá)升高P0.05);假埋線組大鼠海馬神經(jīng)元ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62mRNA表達(dá)則無明顯差異。結(jié)論:1.D-半乳糖致衰模型大鼠和復(fù)合衰老模型大鼠在一般狀態(tài)、自主活動能力、學(xué)習(xí)認(rèn)知能力、海馬的一般病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)以及超微結(jié)構(gòu)等方面都出現(xiàn)了衰老變化,自噬的活性下降,而慢性應(yīng)激可使D-半乳糖致衰模型大鼠的以上行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方面的衰老改變更加嚴(yán)重,說明復(fù)合衰老模型大鼠的模型建立成功。2.穴位埋線對復(fù)合衰老模型大鼠的行為學(xué),包括一般狀態(tài)、反映自主活動能力的曠場實(shí)驗(yàn)、反映學(xué)習(xí)認(rèn)知記憶能力的水迷宮實(shí)驗(yàn)都有改善作用。3.穴位埋線可以改善復(fù)合衰老模型大鼠海馬神經(jīng)元的一般病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)以及超微結(jié)構(gòu)。4.穴位埋線通過抑制海馬神經(jīng)元異�？簥^的自噬啟動及自噬小體形成、恢復(fù)自噬溶酶體的清除降解功能常,修復(fù)完整自噬流,清除海馬神經(jīng)元內(nèi)錯誤折疊蛋白或者受損老化的細(xì)胞器,使海馬神經(jīng)元恢復(fù)正常的生理活動,延緩海馬的衰老進(jìn)程�？傊�穴位埋線通過抑制海馬神經(jīng)元異�？簥^的自噬啟動及自噬小體形成、恢復(fù)自噬溶酶體的清除降解功能常,修復(fù)完整自噬流,使大鼠的海馬一般病理組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)得以改善,功能得以恢復(fù),從而使大鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知記憶能力恢復(fù)正常,抗應(yīng)激損傷,延緩衰老的進(jìn)程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R245;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋來新;張長城;王婷;劉珍財;韓貴芳;袁丁;趙海霞;;淫羊藿總黃酮通過抑制MAPK/NF-κB信號通路減輕自然衰老大鼠腦組織炎癥反應(yīng)[J];中國藥理學(xué)通報;2017年01期

2 李小梅;周云龍;高W歐，

本文編號：1381923