發(fā)布時(shí)間：2018-01-07 07:29

  本文關(guān)鍵詞：基因甲基化模式改變?cè)阡X致認(rèn)知功能障礙及腦內(nèi)Aβ沉積中的機(jī)制研究　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分鋁電解職業(yè)人群基因甲基化模式改變與Aβ的關(guān)系目的:通過鋁電解職業(yè)人群現(xiàn)況研究檢出MCI的患病情況,觀察鋁電解職業(yè)人群全基因組,與Aβ相關(guān)的特定基因(APP、BACE1、PS1)甲基化模式改變情況。方法:選取某鋁廠電解車間工人366人,使用簡(jiǎn)短精神狀態(tài)量表(MMSE)+畫鐘試驗(yàn)(CDT)篩取MCI人群,同時(shí)采集空腹抗凝血樣,采用石墨爐原子吸收分光光度法檢測(cè)血清鋁水平;采用甲基化特異性PCR法(MSP)檢測(cè)APP、BACE1和PS1基因甲基化水平;采用ELISA法檢測(cè)全基因組和血清Aβ的含量。同時(shí)應(yīng)用多元線性回歸和logistic回歸分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探討MMSE得分以及MCI檢出率的影響因素,并探討血鋁內(nèi)暴露水平、MMSE得分、與全基因組和特定基因甲基化水平(APP、BACE1、PS1)及Aβ表達(dá)的相關(guān)性。采用1:3病例對(duì)照研究,其中MCI為43人,非MCI為年齡、性別及工齡等相匹配的129人。分析鋁暴露水平、全基因和特定基因甲基化以及Aβ表達(dá)的水平。結(jié)果:(1)鋁電解職業(yè)人群血鋁中值濃度為48.99μg/L(范圍從6.63μg/L~158.8μg/L),并根據(jù)血鋁內(nèi)暴露水平25%和75%可信區(qū)間將鋁作業(yè)工人分為三組:0-34.02μg/L組、34.03-61.42μg/L組和≥61.43μg/L組。(2)MMSE+CDT認(rèn)知量表測(cè)試結(jié)果顯示:不同血鋁水平鋁電解職業(yè)人群的MMSE總分隨著血鋁濃度的增加分別為28.3±1.3、27.8±1.9和27.1±1.8,不同血鋁水平間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);血鋁≥61.4μg/L組在短時(shí)記憶、計(jì)算力和語言能力較0-34.02μg/L組和34.02-61.42μg/L組差異明顯降低(P0.05),尤其是短時(shí)記憶力隨著血鋁濃度的增加,降低非常明顯的。CDT測(cè)試結(jié)果顯示:不同血鋁水平鋁電解職業(yè)人群的CDT分值隨著血鋁濃度的增加分別為3.73±0.96、3.38±1.02和2.41±0.49,三組間差異具有統(tǒng)計(jì)意義。(3)在366例鋁電解工人中檢出MCI為43例(11.7%),其中0-34.02μg/L組有4例(4.4%)、34.02-61.42μg/L組有16例(8.7%)、≥61.43μg/L組23例(25.3%),不同血鋁水平MCI檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(4)應(yīng)用多元線性回歸法分析MMSE總分的主要影響因素是年齡、受教育程度、甘油三酯和血鋁水平(P0.01)。(5)應(yīng)用logistic回歸分析鋁電解職業(yè)人群MCI檢出率與血鋁顯著相關(guān)(OR=2.57,OR的95%CI為1.50~4.41,P0.01),并且與年齡相關(guān)(OR=1.76,OR的95%CI為1.19~2.62,P0.05),同時(shí)與受教育程度也有關(guān)(OR=0.356,OR的95%CI為0.19~0.67,P0.05)。(6)隨著血鋁濃度的增加,鋁電解職業(yè)人群全基因甲基化降低,三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(7)甲基化特異性PCR法(MSP)檢測(cè)結(jié)果提示:≥61.43組APP基因甲基化百分率(13.19%)低于0-34.02組(26.37%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);同樣,≥61.43組BACE1基因甲基化百分率(29.67%)低于低血鋁組(40.66%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而PS1基因甲基化百分率有所降低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(8)ELISA法檢測(cè)血清Aβ的含量發(fā)現(xiàn),34.03-61.42組、≥61.43μg/L組外周血淋巴細(xì)胞Aβ42含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(9)采用1:3病例對(duì)照研究,其中MCI為43人,非MCI年齡、性別及工齡等相匹配的129人。①M(fèi)CI的全基因甲基化水平為15.53%,非MCI全基因甲基化水平為17.54%,兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);②MCI組中發(fā)生APP甲基化的有6例,甲基化百分率為13.95%,而非MCI組中檢出24例,APP甲基化百分率為18.60,兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);③在MCI組中發(fā)生BACE1甲基化的為9例,百分率為20.93%,非MCI組檢出37例,百分率為28.68%,二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。④MCI組PS1甲基化為16例,百分率為37.2%,非MCI組發(fā)生PS1甲基化為52例,百分率為40.31%,二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。⑤與非MCI組相比,MCI組外周血淋巴細(xì)胞Aβ42含量明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:鋁電解職業(yè)人群現(xiàn)況研究結(jié)果提示,長(zhǎng)期鋁暴露可能是引起認(rèn)知功能障礙(MCI),進(jìn)而發(fā)展為阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病危險(xiǎn)因素之一,當(dāng)鋁電解職業(yè)人群全基因低甲基化,特定基因APP和BACE1低甲基化時(shí),發(fā)生MCI的危險(xiǎn)性可能增大。同時(shí)提示基因甲基化可能參與了鋁致認(rèn)知功能損害的過程,并且通過早期血液指標(biāo)的檢測(cè)可能反應(yīng)出腦組織的變化情況。第二部分阿爾茨海默病人群基因甲基化模式改變與Aβ的關(guān)系目的:通過對(duì)阿爾茨海默病(AD)人群現(xiàn)況研究,觀察AD人群全基因組,與Aβ相關(guān)的特定基因(APP、BACE1、PS1)甲基化模式改變情況。方法:使用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(MMSE)和臨床癡呆評(píng)定量表(CDR)來評(píng)價(jià)AD人群的認(rèn)知水平及認(rèn)知損害程度,從中選取輕度認(rèn)知功能障礙組(MCI)50人,輕度AD組50人、中度AD組50人以及重度AD組50人。同時(shí)選擇年齡、性別和受教育程度相匹配的正常對(duì)照人群100人。采用石墨爐原子吸收分光光度法檢測(cè)血清鋁水平;采用甲基化特異性PCR法(MSP)檢測(cè)APP、BACE1和PS1基因甲基化水平;采用ELISA法檢測(cè)血清Aβ的含量,分析AD人群血鋁水平、全基因組和特定基因甲基化水平以及Aβ表達(dá)水平。結(jié)果:(1)對(duì)照組血鋁中值濃度為33.1μg/L(范圍從6.9μg/L~58.8μg/L)。AD人群血鋁中值濃度為43.5μg/L(范圍從7.9μg/L~65.3μg/L),AD人群血鋁水平較對(duì)照組有明顯差別的(P0.05)。(2)MMSE認(rèn)知量表測(cè)試結(jié)果顯示:對(duì)照組的MMSE總分為28.3±1.3,MCI組為24.6±2.4兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各AD組隨著病情的加重,MMSE總分值降低,分別為22.1±1.9、16.7±2.8和5.8±9.4,與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),并與MCI組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)AD患者M(jìn)MSE問卷得分主要與性別、年齡、文化程度和血鋁水平有線性回歸關(guān)系(P0.01),其中與性別呈負(fù)相關(guān)。(4)對(duì)照組全基因甲基化百分率為19.57%,MCI組全基因甲基化百分率為15.15%;輕度、中度和重度AD組全基因甲基化百分率為14.19%、13.50%和11.17%;與對(duì)照組比較,MCI組和輕度、中度、重度AD組全基因組甲基化水平降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與MCI組比較,中度、重度AD組全基因組甲基化水平降低明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)甲基化特異性PCR法(MSP)檢測(cè)結(jié)果顯示:①對(duì)照組APP甲基化百分率(32%),隨著認(rèn)知損害程度的加重,MCI組和輕度、中度、重度AD組APP甲基化的百分率是降低的,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與MCI組甲基化百分率(26%)進(jìn)行比較,輕度、中度、重度AD組的APP異常甲基化的百分率降低明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);②對(duì)照組BACE1甲基化百分率(37%),隨著AD病情的加重,輕度、中度、重度BACE1甲基化的百分率是降低的,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);③阿爾茨海默病人群PS1異常甲基化的百分率,與對(duì)照組甲基化百分率(34%)進(jìn)行比較,PS1基因甲基化的百分率無降低趨勢(shì),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與MCI組甲基化百分率(48%)進(jìn)行比較,輕度AD組和重度AD組的PS1異常甲基化的百分率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)ELISA法檢測(cè)血清Aβ的含量發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,MCI組和輕度、中度、重度AD組外周血淋巴細(xì)胞Aβ42含量明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與MCI組比較,輕度、中度、重度AD組外周血淋巴細(xì)胞Aβ42含量增加明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:AD人群現(xiàn)況研究結(jié)果提示,高齡、女性、文化水平低和血鋁水平高可能是AD的高危因素;AD人群的全基因低甲基化,特定基因APP和BACE1也發(fā)生低甲基化,低甲基化的基因可增強(qiáng)基因表達(dá)或過表達(dá),導(dǎo)致AD外周血Aβ的表達(dá)量增高,這與本次鋁電解車間工人的研究結(jié)果相一致。鋁電解職業(yè)人群的基因甲基化模式改變與AD一致,提示鋁電解職業(yè)人群可能存在和AD人群一樣的DNA甲基化模式。進(jìn)一步證實(shí)DNA甲基化參與了鋁致Aβ沉積相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控,這為完善鋁導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙、甚至AD的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。第三部分基因甲基化模式改變?cè)阡X致大鼠腦內(nèi)Aβ沉積的作用機(jī)制研究目的:探討麥芽酚鋁Al(mal)3對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其與腦組織Aβ蛋白沉積相關(guān)基因的甲基化模式改變情況。方法:大鼠采用腹腔注射Al(mal)3進(jìn)行染毒,將40只SD大鼠按體重隨機(jī)分成4組,生理鹽水組,10μM/kg、20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3組,每組10只。每天腹腔注射0.1m L/100g,濃度為40mmol/L的Al(mal)3進(jìn)行染毒,對(duì)照組給予等量生理鹽水,連續(xù)5天,休息2天,共8周。采用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的認(rèn)知功能;處死大鼠取空腹抗凝血樣和腦組織,分別按照以下方法檢測(cè)血、腦組織中各項(xiàng)指標(biāo)。采用石墨爐原子吸收分光光度法檢測(cè)血清鋁和腦鋁水平;測(cè)定全基因組和APP、BACE1和PS1基因甲基化水平;采用q RT-PCR檢測(cè)APP、BACE1和PS1的m RNA表達(dá)水平;采用ELISA法檢測(cè)APP、BACE1、PS1和Aβ蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)水迷宮大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示:在同一天中,各染毒組大鼠的逃避潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而鋁各劑量染毒組大鼠的目標(biāo)象限停留時(shí)間與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對(duì)照組相比,20μM/kg Al(mal)3、40μM/kg Al(mal)3組大鼠穿越平臺(tái)位置次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)各組大鼠血鋁及海馬鋁檢測(cè)結(jié)果示,與生理鹽水組比,各劑量Al(mal)3染毒組大鼠的血鋁含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨染毒劑量的增加大鼠的腦鋁含量逐漸增多,與生理鹽水組比,20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3組大鼠的腦鋁含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)隨Al(mal)3染毒劑量的增加大鼠外周血和海馬全基因組甲基化率降低,與生理鹽水組比,20μM/kg Al(mal)3組、40μM/kg Al(mal)3組的大鼠的全基因組甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)甲基化特異性PCR法(MSP)檢測(cè)結(jié)果提示:APP、BACE1基因甲基化水平是降低的,而PS1基因甲基化水平較生理鹽水組未見明顯變化,并且血和海馬中的變化一致。(5)RT-PCR結(jié)果,20μM/kg Al(mal)3組、40μM/kg Al(mal)3組的海馬APP、BACE1和PS1基因m RNA的表達(dá)水平與生理鹽水組比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);20μM/kg Al(mal)3組、40μM/kg Al(mal)3組大鼠外周血APP、BACE1基因m RNA的表達(dá)水平與生理鹽水組比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而外周血PS1基因m RNA的表達(dá)水平僅40μM/kg Al(mal)3組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)ELISA法檢測(cè)外周血和海馬APP、BACE1、PS1和Aβ的含量發(fā)現(xiàn):①隨Al(mal)3染毒劑量的增加大鼠外周血、海馬中APP蛋白濃度逐漸增加,與生理鹽水組比,20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3組APP蛋白濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。②大鼠外周血、海馬PS1蛋白濃度隨Al(mal)3染毒劑量的增加逐漸增加,與生理鹽水組比,40μM/kg Al(mal)3組PS1蛋白濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。③大鼠外周血、海馬中BACE1結(jié)果,與生理鹽水組相比,20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3組的大鼠海馬中BACE1蛋白濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。④與生理鹽水組比,各劑量Al(mal)3染毒組大鼠外周血、海馬Aβ42蛋白濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察鋁致Aβ沉積相關(guān)基因甲基化模式改變情況,以及鋁對(duì)特定基因(APP、PS1、BACE1)的m RNA、蛋白和Aβ表達(dá)水平的影響,并嘗試將全基因、APP和BACE1基因甲基化作為鋁致神經(jīng)毒性的生物標(biāo)志物,進(jìn)而完善鋁神經(jīng)毒性的作用機(jī)制,為鋁毒性從DNA水平進(jìn)行預(yù)防及治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R135

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊焱;張勤麗;郭衛(wèi)力;吉秀亮;潘寶龍;牛僑;;氯化鋁致原代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)細(xì)胞毒性作用及對(duì)mGluR3表達(dá)的影響[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2010年01期

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本文編號(hào)：1391586