發(fā)布時間：2018-01-07 09:34

  本文關鍵詞：IFN-Lambda 3協(xié)同索拉非尼對肝癌細胞體外增殖及裸鼠肝癌移植瘤生長抑制的實驗研究　出處：《蘭州大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:索拉非尼廣譜的分子激酶抑制效用提示能夠與抗病毒作用藥物的新型細胞因子IFN-Lambda 3聯(lián)合加強對肝細胞型肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)治療的臨床獲益,在這里,我們首次評價聯(lián)同使用IFN-Lambda 3作為索拉非尼在HCC的輔助治療。在第一部分研究中,我們旨嘗試在通過人肝癌細胞株的體外水平展開實驗研究,觀察兩種藥物的聯(lián)合用藥模式,是否具有對人肝癌細胞株存在協(xié)同的增殖抑制作用及激發(fā)細胞凋亡途徑的開始,并初步探討其可能的潛在的相關機制;同時為了更好的探究兩種藥物制劑的聯(lián)合用藥模式是否具有潛在的抗肝臟惡性腫瘤的效果與臨床實踐應用的價值。在第二部分研究中,我們選擇應用之前體外實驗篩選出的IFN-Lambda受體復合物表達陽性的人肝癌細胞株,建立免疫缺陷裸鼠異種移植腫瘤模型,觀察聯(lián)合兩種藥物制劑對裸鼠皮下肝癌移植瘤生長的影響,以此進行最終評價。方法:(1)離體細胞培養(yǎng)人肝癌細胞株Hep G2、SMMC-7721、SK-HEP-1、BEL-7402與正常人肝臟細胞株L-02,并取材HCC手術患者人體肝癌組織新鮮標本,實時定量-PCR篩選檢測特異性IFN-Lambda受體復合物(IL-28R1和IL-10R2)的基因表達水平,確定陽性表達IL-28R1和IL-10R2 m RNA的細胞株,從中選擇兩種人肝癌細胞株作為靶細胞,進行后續(xù)平行獨立實驗;(2)常規(guī)培養(yǎng)上述實驗確定的兩株細胞,采用索拉非尼和/或IFN-Lambda 3作為體外細胞干預藥物,實驗分組如下:1)對照組:正常條件下培養(yǎng)人肝癌細胞株;2)IFN-Lambda 3處理組:培養(yǎng)人肝癌細胞株,添加10ng/m L的藥物處理細胞;3)Sorafenib處理組:培養(yǎng)人肝癌細胞株,添加3μmol/L的藥物處理細胞;4)IFN-Lambda 3+Sorafenib聯(lián)合處理組:培養(yǎng)人肝癌細胞株,添加10ng/m L的IFN-Lambda 3和3μmol/L的索拉非尼處理細胞。上述選擇的兩株細胞,分別培養(yǎng)24小時與48小時后收集細胞,CCK-8檢測細胞的存活率、平板克隆試驗檢測細胞的群體依賴性與克隆增殖形成能力;(3)24小時與48小時后,流式細胞儀檢測觀察兩種人肝癌細胞株四個分組藥物干預后的細胞周期以及細胞凋亡的變化、細胞線粒體膜電位改變以及細胞內活性氧簇物質的釋放情況;(4)48小時后收集細胞,蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測兩種人肝癌細胞株四個分組細胞內的p21、cyclin D1和cleaved-caspase-3蛋白質水平的表達情況;(5)采取體外實驗篩選出的IFN-Lambda受體復合物表達陽性的人肝癌細胞株SMMC-7721,選擇對數期生長狀態(tài)較好的細胞建立裸鼠皮下移植瘤動物模型,根據藥物干預方式的不同持續(xù)治療四周,將16只裸鼠分為如下四組:1)對照組:給予2ml/kg生理鹽水處理;2)IFN-Lambda 3處理組:給予0.1mg/kg的藥物處理;3)Sorafenib處理組:給予5mg/kg的藥物處理;4)IFN-Lambda 3+Sorafenib聯(lián)合處理組:給予0.1mg/kg的IFN-Lambda 3和5mg/kg的索拉非尼處理;(6)監(jiān)測成瘤裸鼠在IFN-Lambda 3和/或索拉非尼干預下一般情況及移植瘤體積大小;實驗四周期結束后采用病理學技術蘇木素-伊紅及免疫組織化學染色法,鏡下檢測裸鼠移植瘤組織中腫瘤細胞的病理形態(tài)和增殖蛋白Ki-67的表達改變,并進一步TUNEL染色觀察誘導凋亡細胞個數。結果:人肝癌細胞株Hep G2、SMMC-7721及BEL-7402和取材HCC手術患者的肝癌組織標本,都在基因水平存在IFN-Lambda受體復合物(IL-28R1和IL-10R2)m RNA的表達,但是SK-HEP-1細胞株表達為陰性;CCK-8和平板克隆試驗表明索拉非尼和IFN-Lambda 3協(xié)同抑制人肝癌細胞株(Hep G2和SMMC-7721)體外生長增殖;流式細胞儀檢測顯示索拉非尼和IFN-Lambda 3協(xié)同激發(fā)細胞凋亡并阻滯分裂間期G0/G1期,而且可以促進細胞線粒體膜電位的損失和細胞內活性氧簇物質的釋放;蛋白質水平表現(xiàn)為增加p21的表達和觸發(fā)cleaved-caspase-3的活性,并且抑制cyclin D1的表達。在體內裸鼠實驗模型治療四周后,對照組腫瘤體積大小顯現(xiàn)為遞增生長的趨勢,余3個藥物處理組腫瘤生長均現(xiàn)抑制效應。從中發(fā)現(xiàn)對裸鼠兩種藥物單獨干預可減小移植瘤體積,IFN-Lambda 3+Sorafenib聯(lián)合處理組對移植瘤體積大小的改變最明顯,與對照組比較差異具有極顯著的統(tǒng)計學意義(p0.01),同時與IFN-Lambda 3單藥組和Sorafenib單藥組相比差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05);此外,免疫組化技術分析切除的移植瘤組織中Ki-67蛋白表達水平表明,3個藥物處理組中的裸鼠形成的皮下移植瘤與對照組相比顯示出較低的Ki-67陽性增殖率,而IFN-Lambda 3+Sorafenib聯(lián)合處理組中的裸鼠移植瘤組織內表現(xiàn)出最低的Ki-67陽性增殖率,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05);TUNEL染色檢測切除的移植瘤組織中的細胞凋亡數目,與對照組相比,3個藥物處理組中的裸鼠在其皮下移植瘤中顯示出較高的細胞凋亡率,其中IFN-Lambda 3+Sorafenib聯(lián)合處理組中出現(xiàn)最高的凋亡率,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論:索拉非尼與IFN-Lambda 3能夠在體外細胞水平聯(lián)合作用于人肝癌細胞株(Hep G2和SMMC-7721)表現(xiàn)出協(xié)同效應,其機制可能是抑制細胞增殖生長與激發(fā)細胞凋亡途徑的開始,使細胞分裂間期G0/G1期停滯,促進線粒體膜電位的損失和誘導細胞內活性氧簇物質的產生釋放,并且影響細胞周期相關調控蛋白(p21與cyclin D1)和凋亡蛋白(cleaved-caspase-3)的表達水平;同時兩種藥物制劑顯著抑制裸鼠體內人肝癌細胞株SMMC-7721皮下移植瘤的生長,具有協(xié)同作用,并與抑制皮下移植瘤的細胞增殖和誘發(fā)凋亡有關,證實二者聯(lián)合用藥模式可以在體內水平治療HCC。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of the combination of two kinds of drugs on the growth of human liver cancer cell line ( HCC ) in vitro . In the second part , we have selected two kinds of human liver cancer cell lines to express positive expression of IL - 28R1 and IL - 10R2 . ( 4 ) The expression of p21 , cyclin D1 and IL - caspase - 3 protein in four groups of human liver cancer cell lines was detected by flow cytometry after 24 hours and 48 hours . Compared with control group , the expression level of Ki - 67 in nude mice was significantly higher than that in control group ( p < 0.05 ) .

【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1392003