本文關(guān)鍵詞：草魚白細(xì)胞介素10的免疫調(diào)節(jié)功能及其作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

電子科技大學(xué)

2015年；博士論文

韋鶴； 周紅；

在哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中,白細(xì)胞介素10(Interleukin-10,IL-10)被認(rèn)為是具有多重功能的重要細(xì)胞因子。IL-10由多種細(xì)胞分泌并作用于各種免疫細(xì)胞,如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞,調(diào)控這些細(xì)胞的生長、成熟、增殖、分化與活化,進(jìn)而影響機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫,并與其它細(xì)胞因子一起維持了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。硬骨魚IL-10在多種魚類包括斑馬魚、金魚、鯉魚和虹鱒中被克隆鑒定,但有關(guān)硬骨魚IL-10的免疫調(diào)節(jié)功能知之甚少,其受體和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑,以及作用機(jī)制均有待闡明。本論文研究草魚IL-10的免疫學(xué)功能,不僅揭示其保守的抑炎癥功能,而且闡明它和另一經(jīng)典抑炎癥細(xì)胞因子TGF-β1參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的相互關(guān)系和作用機(jī)制,從而拓展了對(duì)魚類IL-10免疫學(xué)地位的認(rèn)識(shí)。另外,為了解草魚IL-10發(fā)揮作用的分子機(jī)制,進(jìn)一步鑒定了草魚IL-10介導(dǎo)的IL-10受體1(IL-10R1)和IL-10受體2(IL-10R2)及其下游信號(hào)通路(STAT3)和靶基因細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控蛋白3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)。為獲悉草魚IL-10的產(chǎn)生機(jī)制,初步探討了LPS和IFN-γ對(duì)草魚IL-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。具體研究內(nèi)容如下:1.重組草魚IL-10蛋白的活性鑒定和參與的免疫刺激作用:(1)通過硬骨魚同源序列比對(duì)克隆獲得草魚IL-10 cDNA全長序列,并用生物信息學(xué)方法分析其結(jié)構(gòu)域與保守特性。(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法檢測(cè)草魚IL-10在各組織中的表達(dá),結(jié)果表明草魚IL-10主要在免疫相關(guān)組織頭腎、腎、鰓中有較高表達(dá),提示草魚IL-10可能參與免疫相關(guān)反應(yīng)。(3)構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)并采用親和純化法獲得高純度重組草魚IL-10蛋白,利用此蛋白研究草魚IL-10免疫學(xué)功能。(4)細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明草魚IL-10能夠促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞PBLs的細(xì)胞活性。相似地,轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)也能促進(jìn)PBLs的細(xì)胞活性。(5)為揭示上述作用的機(jī)制,采用草魚IL-10免疫中和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)草魚TGF-β1是依賴于IL-10發(fā)揮上調(diào)PBLs細(xì)胞活性的作用。(6)上述結(jié)論得到進(jìn)一步支持,即qPCR和競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫吸附(CI-ELISA)實(shí)驗(yàn)表明草魚TGF-β1促進(jìn)IL-10的mRNA表達(dá)和蛋白分泌水平,從而證明TGF-β1可能通過誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生來上調(diào)PBLs的細(xì)胞活性。本章證明了重組草魚IL-10的免疫刺激作用,特別是揭示了魚類TGF-β1和IL-10在發(fā)揮免疫刺激作用中的上下游關(guān)系。2.草魚IL-10和TGF-β1在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的作用和相互關(guān)系:(1)在草魚頭腎單核/巨噬細(xì)胞中,加入的草魚il-10和tgf-β1均抑制lps刺激促炎癥信號(hào)因子tnf-α、il-1β、inos和il-8的表達(dá)。(2)相反地,草魚il-10和tgf-β1的抗體均放大lps對(duì)上述促炎癥信號(hào)因子mrna的上調(diào)作用,提示內(nèi)源的il-10與tgf-β1發(fā)揮了抑制促炎癥因子表達(dá)的作用。(3)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),草魚il-10與tgf-β1均能促進(jìn)草魚iκbα全蛋白的表達(dá),即抑制iκbα的降解從而抑制nf-κb通路的激活,表明草魚tgf-β1和il-10可能通過抑制nf-κb信號(hào)通路控制lps誘導(dǎo)的促炎癥因子表達(dá)。(4)草魚il-10抗體和tgf-β1抗體分別對(duì)tgf-β1和il-10的調(diào)節(jié)作用不產(chǎn)生影響,提示在lps激活的頭腎單核/巨噬細(xì)胞中,tgf-β1與il-10獨(dú)立發(fā)揮抑制功能。這些結(jié)果驗(yàn)證了魚類il-10的抑炎癥作用及其機(jī)制,以及與另一抑炎癥因子tgf-β1平行發(fā)揮作用的關(guān)系,從而豐富了魚類炎癥反應(yīng)控制機(jī)制的知識(shí)。3.草魚il-10受體及信號(hào)通路的鑒定:(1)采用同源克隆技術(shù)獲得了草魚il-10受體1(il-10r1)、細(xì)胞因子受體家族成員4(cytokinereceptorfamilymember4,crfb4)以及細(xì)胞因子受體家族成員5(crfb5),并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。(2)qpcr檢測(cè)結(jié)果表明草魚il-10r1表達(dá)于鰓、胸腺、脾、頭腎等免疫相關(guān)組織,而草魚crfb4與crfb5則廣泛表達(dá)于各檢測(cè)組織,展現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物同系基因類似的表達(dá)特性。(3)構(gòu)建這三種受體的真核表達(dá)質(zhì)粒,在草魚腎細(xì)胞系cik中,通過對(duì)stat3控制的熒光素酶的活性檢測(cè),證明了草魚il-10r1在il-10信號(hào)傳導(dǎo)中的必要地位,以及草魚il-10能夠上調(diào)stat3的活性。更重要的,首次證明了crfb4而不是crfb5作為草魚il-10r2。(4)分離克隆草魚socs3啟動(dòng)子區(qū)域,并構(gòu)建草魚socs3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及其stat結(jié)合位點(diǎn)的突變體,熒光素酶的活性檢測(cè)表明草魚stat3介導(dǎo)il-10對(duì)socs3啟動(dòng)子活性的上調(diào)作用。(5)在原代細(xì)胞草魚頭腎白細(xì)胞hkls中,免疫印跡和qpcr結(jié)果證明草魚il-10激活stat3信號(hào)通路并介導(dǎo)socs3mrna的表達(dá)。這些工作闡明了草魚il-10調(diào)節(jié)靶基因socs3轉(zhuǎn)錄的il-10r1/crfb4/stat3信號(hào)通路。4、草魚il-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析:(1)在草魚頭腎單核/巨噬細(xì)胞中,lps通過mapk/erk和nf-κb信號(hào)通路上調(diào)il-10mrna表達(dá)。(2)在草魚頭腎單核/巨噬細(xì)胞中,重組草魚ifn-γ抑制il-10mrna的表達(dá),參與的信號(hào)通路為mapk/erk。(3)lps上調(diào)草魚il-10啟動(dòng)子活性,而重組草魚ifn-γ抑制il-10啟動(dòng)子的活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同的刺激作用通過不同的信號(hào)途徑調(diào)控il-10的表達(dá)。本論文揭示了草魚il-10的免疫調(diào)節(jié)功能,包括刺激免疫細(xì)胞活性的新發(fā)現(xiàn)和在炎癥反應(yīng)中的經(jīng)典抑制功能,特別明確了兩種重要抑炎癥因子il-10與TGF-β1在上述調(diào)節(jié)作用中的相互關(guān)系和作用機(jī)制,鑒定了草魚IL-10的特異受體IL-10R1和輔助受體CRFB4,闡明了草魚IL-10激活STAT3信號(hào)通路和靶基因SOCS3,且探討了不同誘導(dǎo)條件下IL-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。本論文的結(jié)果不僅填補(bǔ)了硬骨魚IL-10功能特性、相關(guān)作用機(jī)制和信號(hào)通路等重要信息,而且揭示了基于不同細(xì)胞因子相互關(guān)系的魚類免疫調(diào)節(jié)新機(jī)制。

  本文關(guān)鍵詞：草魚白細(xì)胞介素10的免疫調(diào)節(jié)功能及其作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。