發(fā)布時(shí)間：2016-11-25 23:30

  本文關(guān)鍵詞：Shox2介導(dǎo)HCN4基因修飾犬MSCs定向分化心臟起搏樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第三軍醫(yī)大學(xué)》 2015年

Shox2介導(dǎo)HCN4基因修飾犬MSCs定向分化心臟起搏樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

馮媛媛  

【摘要】：背景和目的近年來,隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因工程學(xué)及細(xì)胞移植技術(shù)的快速發(fā)展,心臟“生物起搏”(biologicɑl pɑcemɑker)研究已成為探索治療緩慢性心律失常新方法的又一熱點(diǎn)。而縱觀心臟生物起搏研究歷程,主要經(jīng)歷了“細(xì)胞治療、基因轉(zhuǎn)移及基因細(xì)胞治療”三個(gè)階段,而“基因細(xì)胞治療”是將起搏基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞后再注入心臟,共同增強(qiáng)心臟生物起搏功能。起搏電流(current funny,If)是竇房結(jié)細(xì)胞舒張期自動(dòng)除極化的主要決定因素。超極化激活的環(huán)化核苷酸門控通道(HCN)基因家族是If形成的分子基礎(chǔ),HCN基因家族有四個(gè)成員:HCN1~HCN4,其中HCN4在動(dòng)物竇房結(jié)細(xì)胞的比例最高,是If產(chǎn)生及維持基本竇性心律的重要因素。近年來,本課題組對(duì)HCN4基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymɑl stem cells,MSCs)體外誘導(dǎo)分化及重建心臟生物起搏點(diǎn)進(jìn)行了系列研究,不僅在體外成功誘導(dǎo)出可穩(wěn)定表達(dá)HCN4、且具有自主搏動(dòng)特性的心臟起搏樣細(xì)胞;而將HCN4基因修飾的MSCs移植至Ⅲo房室傳導(dǎo)阻滯犬心室肌,4周后可記錄到起源于移植部位的室性自主節(jié)律,但因其頻率較慢(59±5次/分),不能滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理需要。因而導(dǎo)入新的功能基因,使HCN4基因修飾的MSCs移植后繼續(xù)保持起搏細(xì)胞基因表型及起搏功能,已成為心臟生物起搏研究的新策略。既往研究顯示,竇房結(jié)發(fā)育是一嚴(yán)格的基因調(diào)控過程,許多基因參與了該調(diào)控網(wǎng)絡(luò),包括HCN4、Tbx3、Nkx2.5和Shox2。同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(homeodomɑin trɑnscription fɑctor)Shox2是近年發(fā)現(xiàn)的重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,只在竇房結(jié)區(qū)域特異性表達(dá)。Shox2的無效突變可導(dǎo)致胚胎死亡,Tbx3和HCN4表達(dá)下降。在爪蟾和小鼠胚胎中過表達(dá)Shox2能下調(diào)Nkx2.5的表達(dá),說明Shox2通過抑制Nkx2.5,在竇房結(jié)分化過程中具有重要的作用。但Shox2對(duì)HCN4的調(diào)控及維持起搏細(xì)胞基因表型的作用及機(jī)理尚不十分清楚。我們推測(cè)Shox2通過抑制Nkx2.5而上調(diào)Tbx3與HCN4表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)HCN4基因修飾的MSCs移植后繼續(xù)保持起搏細(xì)胞基因表型及起搏功能,達(dá)到提高新建生物起搏點(diǎn)起搏頻率之目的。為驗(yàn)證上述理論假設(shè),本研究擬采用雙基因轉(zhuǎn)染技術(shù),將Shox2與HCN4雙基因共同轉(zhuǎn)染至犬MSCs,并行脈沖微電流刺激(electric pulse current stimulɑtion,EPCS)模擬體內(nèi)微電環(huán)境,在體外進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng),以獲得具有心臟起搏細(xì)胞特性的起搏樣細(xì)胞,為在體心臟生物起搏研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法1.參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行犬MSCs分離、培養(yǎng)與鑒定,而后進(jìn)行MSCs純化及擴(kuò)增,倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。2.慢病毒載體構(gòu)建:分別構(gòu)建攜帶HCN4+GFP、Shox2+RFP基因及僅含RFP的慢病毒載體,獲得p Lentis-HCN4-GFP、p Lentis-Shox2-RFP及p Lentis-RFP。病毒載體內(nèi)攜帶嘌呤霉素抗藥基因可用于細(xì)胞純化。3.將已構(gòu)建好的慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染至第3代生長(zhǎng)良好的c MSCs,獲得以下四組。①HCN4組:轉(zhuǎn)染p Lentis-HCN4-GFP。②Shox2組:轉(zhuǎn)染p Lentis-Shox2-RFP。③Shox2-HCN4組:共轉(zhuǎn)染p Lentis-Shox2-RFP和p Lentis-HCN4-GFP。④對(duì)照組(RFP組):只轉(zhuǎn)染p Lentis-RFP。轉(zhuǎn)染前行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定慢病毒的最佳細(xì)胞轉(zhuǎn)染密度、最佳轉(zhuǎn)染體系、共轉(zhuǎn)染的最佳轉(zhuǎn)染體系,必要時(shí)可用嘌呤霉素篩選純化轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞。各組細(xì)胞分別進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。4.對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后的各組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)①細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè):光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞大小及形態(tài)結(jié)構(gòu)特征;透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間連接特征。②免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞Shox2、HCN4、Cx43、Cx45、c Tn T蛋白表達(dá)。③分別用定量RT-PCR(q RT-PCR)、Western blotting方法檢測(cè)相關(guān)基因m RNA和蛋白表達(dá)情況,如:Shox2、Nkx2.5、Tbx3、HCN4、Cx43、Cx45等。④細(xì)胞電生理學(xué)檢測(cè):選擇培養(yǎng)至5-7天的細(xì)胞,用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞膜電流If表達(dá)情況。5.EPCS誘導(dǎo)經(jīng)Shox2、HCN4基因修飾的c MSCs分化為心臟起搏樣細(xì)胞(1)實(shí)驗(yàn)分組①基因轉(zhuǎn)染組:又分為HCN4組、Shox2組、Shox2-HCN4組、RFP組(對(duì)照組)。②基因轉(zhuǎn)染+EPCS誘導(dǎo)組:又分為HCN4+EPCS組、Shox2+EPCS組、Shox2-HCN4+EPCS組、RFP+EPCS組。(2)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與檢測(cè)①將基因轉(zhuǎn)染+EPCS誘導(dǎo)組細(xì)胞傳代到60 mm的培養(yǎng)皿中,鉑金絲為電極導(dǎo)絲。②在細(xì)胞種植后第二天即開始行EPCS,每天刺激3-6 h,刺激5天直到細(xì)胞達(dá)到95%增殖,中途換液1次。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。③取EPCS刺激第5天的轉(zhuǎn)染+EPCS誘導(dǎo)組細(xì)胞,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞為同一代數(shù)培養(yǎng)第5天的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)方法與內(nèi)容同方法4。結(jié)果1.犬MSCs的分離、培養(yǎng)采用全細(xì)胞貼壁篩選分離法培養(yǎng)c MSCs,原代細(xì)胞48 h首次換液后,貼壁細(xì)胞呈類圓形、多角形、短梭形,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。5~7天后貼壁細(xì)胞分裂增殖加快,相鄰細(xì)胞之間逐漸匯合,可見集落形成,10~14天細(xì)胞生長(zhǎng)融合可達(dá)80%,呈渦旋狀或放射狀分布排列。傳代培養(yǎng)后c MSCs貼壁速度比原代細(xì)胞快,呈均勻分布生長(zhǎng)。隨著細(xì)胞換液和傳代,貼壁細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致;傳代至第3代時(shí)可得到純化的呈典型多邊形或長(zhǎng)梭形的細(xì)胞,胞體飽滿,折光性好,具有良好的增殖能力。2.慢病毒載體介導(dǎo)Shox2、HCN4雙基因轉(zhuǎn)染犬MSCs(1)轉(zhuǎn)染效率的比較①單獨(dú)轉(zhuǎn)染p Lentis-Shox2-RFP、p Lentis-HCN4-GFP:以1.0×104 cells/cm2的密度傳代,在次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到50~60%匯合;慢病毒轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI=20,聯(lián)合助轉(zhuǎn)染劑polybrene 2ug/ml,轉(zhuǎn)染時(shí)間24 h,該條件下行轉(zhuǎn)染可取得良好的效果。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72~96 h,HCN4組細(xì)胞可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白GFP的表達(dá);Shox2組細(xì)胞可觀察到紅色熒光蛋白R(shí)FP的表達(dá),兩組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,熒光蛋白表達(dá)呈增多、增強(qiáng)的趨勢(shì)。在MOI=20時(shí),HCN4組和Shox2組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為92±3.7%和94±2.5%(n=5),與對(duì)照組RFP組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)(96±3.5%)。說明此兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率良好。②共轉(zhuǎn)染p Lentis-Shox2-RFP和p Lentis-HCN4-GFP:以1.0×104 cells/cm2的密度傳代,在次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到50~60%,給予先轉(zhuǎn)染Shox2(MOI=20,polybrene 2ug/ml);24h后棄去廢液,重新加入慢病毒HCN4(MOI=27,polybrene 2ug/ml)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):聯(lián)合HCN4共轉(zhuǎn)染72 h后,Shox2-HCN4組細(xì)胞可在熒光顯微鏡下觀察到紅綠兩種熒光蛋白混合表達(dá)(偏紅色、偏綠色、混合橙色),激光共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)Shox2-HCN4共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例為85±2.3%(n=5),共轉(zhuǎn)染效率較高。(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化轉(zhuǎn)染慢病毒后,HCN4組、Shox2組和Shox2-HCN4組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)變慢,其中Shox2-HCN4組細(xì)胞生長(zhǎng)更慢。三組細(xì)胞形狀也發(fā)生了巨大的變化,顯微鏡下可見少數(shù)細(xì)胞呈分叉和長(zhǎng)棒形。(3)免疫熒光結(jié)果分析免疫熒光結(jié)果顯示,HCN4組細(xì)胞可見HCN4蛋白表達(dá);Shox2組和Shox2-HCN4組細(xì)胞除能表達(dá)Shox2蛋白外,還可見HCN4及心肌特異性標(biāo)志物c Tn T表達(dá),其中以Shox2-HCN4組表達(dá)更顯著。(4)分子生物學(xué)檢測(cè)選擇培養(yǎng)5-7天的各組細(xì)胞,PCR和Western blotting結(jié)果顯示:①HCN4、Tbx3和Cx45:與僅轉(zhuǎn)染RFP的對(duì)照組比較,Shox2組中HCN4、Tbx3和Cx45的m RNA和蛋白表達(dá)均增加;Shox2-HCN4組Tbx3和Cx45增加較Shox2組更顯著;HCN4組中可見Cx45的表達(dá)。②Nkx2.5及Cx43:與僅轉(zhuǎn)染RFP的對(duì)照組比較,Shox2組Nkx2.5、Cx43的m RNA和蛋白表達(dá)均下降;Shox2-HCN4組Nkx2.5、Cx43 m RNA和蛋白表達(dá)下降更為顯著;HCN4組細(xì)胞中可見Cx43的表達(dá)。(5)全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)①Shox2組:32%(6/19)的細(xì)胞可記錄到超極化激活的內(nèi)向電流,該電流具有明顯的時(shí)間及電壓依賴特性,且對(duì)細(xì)胞外Cs+敏感,證實(shí)其為If電流。根據(jù)記錄到的尾電流重建該內(nèi)向電流曲線和翻轉(zhuǎn)電位,并進(jìn)行Boltzmɑnn擬合和計(jì)算,結(jié)果顯示:Shox2組細(xì)胞在-160 m V的電流幅值為-1062.3±18.6 p A,電流密度為-44.3±5.4 p A/p F,半數(shù)最大激活電壓為-94.3±6.3 m V,斜率為-16.8±1.6,翻轉(zhuǎn)電位是-27.4±3.8 m V。②HCN4組:76%(16/21)的細(xì)胞可記錄到If電流,其-160m V的電流幅值為-1081.5±15.4 p A,電流密度為-45.6±7.7 p A/p F,半數(shù)最大激活電壓為-101.2±4.6 m V,斜率為-16.0±1.6,翻轉(zhuǎn)電位是-26.4±3.8 m V。③Shox2-HCN4組:80%(12/15)的細(xì)胞能記錄到If電流,其-160 m V的電流幅值為-2015.1±17.1 p A,電流密度為-67.6±6.7 p A/p F,半數(shù)最大激活電壓為-100.3±4.0m V,斜率為-22.2±2.1,翻轉(zhuǎn)電位是-27.5±3.1 m V。3.經(jīng)EPCS誘導(dǎo)后各組細(xì)胞形態(tài)及功能變化(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化HCN4組、Shox2組和Shox2-HCN4組細(xì)胞給予EPCS誘導(dǎo)后,細(xì)胞體積變大,呈紡錘樣和蜘蛛樣改變。細(xì)胞增殖最終變緩慢。免疫熒光結(jié)果顯示:EPCS誘導(dǎo)后,Shox2組和Shox2-HCN4組細(xì)胞HCN4和c Tn T的表達(dá)更加顯著。(2)分子生物學(xué)檢測(cè)取EPCS刺激第5天的轉(zhuǎn)染+EPCS誘導(dǎo)組細(xì)胞,單純轉(zhuǎn)染組細(xì)胞為同一代數(shù)培養(yǎng)第5天的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。PCR和Western blotting結(jié)果顯示:①HCN4、Tbx3和Cx45:經(jīng)EPCS誘導(dǎo)后,Shox2組HCN4、Tbx3和Cx45的m RNA和蛋白表達(dá)增加較誘導(dǎo)前更顯著(p0.05);Shox2-HCN4組中Tbx3和Cx45增加較誘導(dǎo)前更顯著(p0.05);HCN4組Cx45表達(dá)較誘導(dǎo)前明顯增加(p0.05)。②Nkx2.5及Cx43:經(jīng)EPCS誘導(dǎo)后,Shox2組Nkx2.5、Cx43的m RNA和蛋白表達(dá)均較誘導(dǎo)前明顯下降(p0.05);Shox2-HCN4組Nkx2.5及Cx43表達(dá)量下降較誘導(dǎo)前更加顯著(p0.05);HCN4組Cx43表達(dá)較誘導(dǎo)前明顯增加(p0.05)。(3)全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)①Shox2+EPCS組:73%(16/22)的細(xì)胞可記錄到If電流,-160m V的電流幅值為-1350.1±16.5 p A(p0.05),電流密度為-51.9±8.3 p A/p F(p0.05),半數(shù)最大激活電壓為-91.2±5.1 m V(p0.05),斜率為-17.5±1.8,翻轉(zhuǎn)電位是-29.5±4.2 m V。②HCN4+EPCS組:77%(17/22)的細(xì)胞可記錄到If電流,-160m V的電流幅值為-1343.4±18.6 p A(p0.05),電流密度為-53.7±4.0 p A/p F(p0.05),半數(shù)最大激活電壓為-92.4±4.8 m V(p0.05),斜率為-18.8±1.8(p0.05),翻轉(zhuǎn)電位是-28.9±3.0 m V(p0.05)。③Shox2-HCN4+EPCS組:73%(11/15)的細(xì)胞能記錄到If電流,-160m V的電流幅值為-2380.5±64.8 p A(p0.05),電流密度為-78.5±11.5 p A/p F(p0.05),半數(shù)最大激活電壓為-94.1±4.0 m V(p0.05),斜率為-21.4±1.9,翻轉(zhuǎn)電位是-31.3±3.9 m V。結(jié)論1.應(yīng)用慢病毒載體p Lentis-Shox2-RFP和p Lentis-HCN4-GFP成功將Shox2-HCN4雙基因共同轉(zhuǎn)染入c MSCs。2.c MSCs轉(zhuǎn)染Shox2后,能夠促進(jìn)c MSCs向心臟起搏樣細(xì)胞分化�？捎^察到心肌特異性標(biāo)志物c Tn T,在基因和蛋白水平表達(dá)起搏細(xì)胞標(biāo)志物HCN4,Tbx3和Cx45,而抑制心肌工作細(xì)胞標(biāo)志物Nkx2.5及Cx43的表達(dá),并能產(chǎn)生功能性If起搏電流,具有心臟發(fā)育早期的起搏樣細(xì)胞特點(diǎn)。3.EPCS作為誘導(dǎo)干預(yù)手段能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)染Shox2的c MSCs向起搏樣細(xì)胞分化,使If表達(dá)增多,電流特征良性改變,具有心臟起搏樣細(xì)胞的電生理特點(diǎn)。4.Shox2-HCN4雙基因共轉(zhuǎn)染+EPCS誘導(dǎo),有促進(jìn)c MSCs向起搏樣細(xì)胞方向分化的疊加效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.7
【目錄】：

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7 李葳;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)研究[D];中南大學(xué);2013年

8 張長(zhǎng)海;雷公藤甲素對(duì)HCN4基因修飾大鼠MSCs同種異體心臟移植后細(xì)胞存活影響的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

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4 郭玲玲;ECSOD基因體外轉(zhuǎn)染對(duì)恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響[D];蘇州大學(xué);2012年

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6 李曉艷;光、電刺激對(duì)成肌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶大學(xué);2013年

7 劉苗;HGF復(fù)合Pluronic F-127治療大鼠下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

8 孫宇;風(fēng)濕性瓣膜病心房顫動(dòng)患者心房肌HCN2蛋白的表達(dá)及與房顫危險(xiǎn)因素相關(guān)性的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2014年

9 田甜;SDF-1α復(fù)合Pluronic F-127對(duì)BMSCs體外誘導(dǎo)成骨的實(shí)驗(yàn)觀察[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年

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【相似文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：Shox2介導(dǎo)HCN4基因修飾犬MSCs定向分化心臟起搏樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：193115