發(fā)布時間：2023-05-04 07:53

  一、背景原發(fā)性高血壓是常見也血管疾病,發(fā)病率高,腎臟為高血壓影響的最重要的祀器官。高血壓過程中Angll水平升高,刺激血管內(nèi)皮損傷,使NADPH氧化酶表達增加,ROS生成增多,推動氧化應激,通過多種炎癥信號通路產(chǎn)生大量炎癥細胞因子,因此氧化應激和炎癥共同促進腎臟小動脈血管內(nèi)皮細胞損傷、重構,腎小球系膜增生、肥厚和細胞外基質沉積形成腎損害,并對血壓進一步影響,從而形成惡性循環(huán),這就是我們課題所要研究的高血壓腎損害發(fā)病機制中的非血流動力學因素,而通過文獻研究及前期的預實驗我們發(fā)現(xiàn)N0X4介導的ROS釋放増多,并進一步激活NF-kB信號通路的開放造成炎癥因子釋放増多從而導致腎臟損害是我們研究內(nèi)容的主要方面,另一方面TLR相關信號通路是近年來研巧熱點,其中TLR2/4研究最廣泛與深入,重點表達于腎臟的多個區(qū)域,尤其是存在于腎小球系膜細胞,兩者在介導腎臟纖維化導致腎損害的過程中意義重大。最新指南推薦RASS阻斷劑(ACEI、ARB)為高血壓腎損害的治療藥物,兩者都有明確的療效,但是獲益人群有限,需要有益的補充,當前對高血壓腎損害的治療不但要強調降壓達標帶來的腎保護作用,而且要重視藥物特有的腎保護作用。潛陽育陰顆粒為江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑,主要用1^^治療高血壓及腎損害之"肝腎陰虛"為主,臨床用于治療高血壓腎損害,前期研巧療效顯著,可改善患者癥狀及腎損害各項指標,可做為重要的補充治療方案,相關分子機制雖有初步研究,但主要作用祀點不明確,還需要進一步探討。二、目的本論文首先研究了潛陽育陰顆粒含藥血清對腎小球系膜細胞增殖活力的影響,在明確其具有抑制腎小球系膜細胞増殖的基礎上,研巧了潛陽育陰顆粒含藥血清抑制Angll誘導腎小球系膜細胞增殖相關氧化應激及炎癥信號通路的保護機制;然后根據(jù)前期的實驗選用SH民大鼠做為高血壓腎損害模型,研究了藥物體內(nèi)抗氧化應激及炎癥反應的作用。兩者相互印證闡明潛陽育陰顆粒主要通過重要氧化酶N0X4介導的NF-kB信號通路,部分通過TLR2/4/MyD88信號通路起到防治高血壓腎損害的目的。三、方法1.體內(nèi)實驗WKY大鼠為正常組,SHR隨機等分為4組,分別為模型組(SHR)、潛陽育陰顆粒組(SHR+Q)、貝那普利組(SHR+B)、潛陽育陰顆粒+貝那普利組(SHR+Q+B)。以上每組大鼠8只,灌胃給藥,每日1次,連續(xù)8周。末次給藥1d后,取大鼠腎臟做以下檢測。①前期做過大量的整體動物實驗,實驗報道中已經(jīng)檢測包括潛陽育陰顆粒對SHR大鼠血壓的影響,ELISA法檢測用藥前后血液及腎臟中AngⅡ、AT1R的表達,全自動生化儀和放免法檢測藥物對大鼠腎臟損害相關指標如：尿微量白蛋白(尿m-ALB),尿β2-微球蛋白、尿N-乙酰-p-D-葡萄糖苷酶(尿NAG)的改善作用,采用HE, Masson染色檢測,光鏡下觀察大鼠腎臟局部組織形態(tài)學用藥前后變化,實驗均證明潛陽育陰顆粒具有防治高血壓。腎損害作用,具體結果可參考前期研究[1-5]；②Western Blot法檢測SHR大鼠腎臟局部氧化應激相關指標NOX4；③Western Blot法檢測SHR大鼠腎臟局部相關炎癥反應的指標包括Myd88、TLR4、TLR2、NF-κB P65、 TNF-α、IL-6蛋白量表達的影響。2.體外實驗將Wistar大鼠隨機分為正常組、纈沙坦組、潛陽育陰顆粒組,每組10只,灌胃給藥,制備含藥血清。。腎小球系膜細胞(HMCs)分為5組,除正常組外,其余組均采用10-4mol/L AngⅡ作用于對數(shù)生長期的HMCs建立細胞增殖模型。造模后,根據(jù)預實驗分別給予相應含藥血清干預：正常組(5%無藥大鼠血清)、模型組(5%無藥大鼠血清)、陽性藥組(2.5%纈沙坦含藥血清+2.5%無藥大鼠血清)、潛陽育陰顆粒低劑量組(1.25%潛陽育陰顆粒含藥血清+3.75%無藥大鼠血清)、潛陽育陰顆粒中劑量組(2.5%潛陽育陰顆粒含藥血清+2.5%無藥大鼠血清)、潛陽育陰顆粒高劑量組(5%潛陽育陰顆粒含藥血清)①MTT法檢測潛陽育陰含藥血清對HMCs增殖的干預作用②流式細胞儀檢測ROS含量；③Western blot、RT-PCR分別檢測氧化應激相關指標NOX4, p22phox, GTP-Racl, Racl蛋白及mRNA含量；④Western Blot檢測NF-κB P65、IL-6及TNF-α蛋白表達量；⑤Western blot、RT-PCR分別檢測TLR2、TLR4及MyD88蛋白及mRNA含量；⑥Western blot、RT-PCR分別檢測干擾RNA沉默NOX4后NOX4, p22phox, GTP-Racl,Racl蛋白及mRNA含量,流式細胞儀檢測ROS含量；⑦Western blot、 RT-PCR分別檢測干擾RNA沉默TLR2后TLR2、TLR4及MyD88的蛋白及mRNA含量。⑧Western blot檢測干擾RNA沉默TLR2或NOX4后NF-κB P65、IL-6及TNF-a蛋白表達量。四、結果：1.體內(nèi)實驗①與WKY相比,SHR組TLR2/4、MyD88蛋白表達明顯增加(P0.01)；與SHR相比,SHR+Q組、SHR+B組及SHR+Q+B組對大鼠腎組織TLR2/4、MyD88蛋白表達均明顯下降(P0.01)；而SHR+Q+B組抑制腎組織TLR2/4、MyD88蛋白表達程度極其顯著(P0.01),并優(yōu)于SHR+Q組與SHR+B組；②與WKY相比,SHR組IF-κB P65蛋白表達明顯增加(P0.01)；與SHR相比,SHR+Q組、SHR+B組及SHR+Q+B組對大鼠腎組織NF-κB P65蛋白表達均明顯下降(P0.01)；而SHR+Q+B組抑制腎組織NF-κB P65蛋白表達程度極其顯著(P0.01),并優(yōu)于SHR+Q組與SHR+B組；③與WKY相比,SHR組TNF-α、IL-6蛋白表達明顯增加(P0.01)；與SHR相比, SHR+Q組、SHR+B組及SHR+Q+B組對大鼠腎組織TNF-α、IL-6蛋白表達均明顯下降(P0.01)；而SHR+Q+B組抑制腎組織TNF-a、IL-6蛋白表達程度極其顯著(P0.01),并優(yōu)于SHR+Q組與SHR+B組；④與WKY相比,SHR組NOX4蛋白表達明顯增加(P0.01);與SHR相比,SHR+Q組、SHR+B組及SHR+Q+B組對大鼠腎組織NOX4蛋白表達均明顯下降(P0.01)；而SHR+Q+B組抑制腎組織NOX4蛋白表達程度極其顯著(P0.01),并優(yōu)于SHR+Q組與SHR+B組。2.體外實驗①潛陽育陰顆粒含藥血清對細胞作用24h,均出現(xiàn)不同程度抑制AnglI誘導的細胞過度增殖作用,而中高劑量較低劑量更顯著的抑制細胞過度增殖作用(P0.01)；②AngⅡ對HMCs干預24小時后和正常組相比ROS產(chǎn)生明顯增多(P0.01),而潛陽育陰顆粒含藥血清干預后ROS表達均明顯降低(P0.01),并有可能有劑量依賴性；③AngⅡ刺激HMCs后能夠明顯增加p22phox和NOX4蛋白和mRNA表達量,并激活GTP-Racl (P0.01),潛陽育陰顆粒含藥血清對細胞進行干預之后GTP-Rac1、p22phox、 NOX4的蛋白表達量相對于模型組有顯著下調且呈劑量依賴性(P0.01) , mRNA水平與蛋白western結果吻合。在這所有過程中每一組中的Racl蛋白及mI RNA沒有顯著的改變；④AngⅡ刺激HMCs后NF-κB P65和下游炎癥因子蛋白表達量顯著增加(P0.01)。而潛陽育陰顆粒含藥血清干預后,各蛋白表達量均減少,低濃度抑制效果較明顯,中高濃度效果顯著(P0.01),呈劑量依賴性；⑤AngⅡ刺激HMCs后能夠明顯增加TLR2、TLR4及MyD88的蛋白和mRNA表達量(P0.01),特別是TLR2表達量增加異常明顯,因此后期我們將對其進行RNA干擾實驗,用于求證藥物對此靶點作用。在潛陽育陰顆粒含藥血清干預之后蛋白表達量相對于AngⅡ模型組有顯著下調且呈劑量依賴性(P0.01),mRNA水平與蛋白western結果吻合；⑥采用RNA干擾技術對NOX4的活性抑制24h后,結果顯示NOX4、p22、GTP-Racl的蛋白表達量分別下降72.7%、69.3%、61.8%,同時也抑制ROS生成,和未使用干擾技術對比有顯著性差異(P0.01),造模成功后再次觀察潛陽育陰顆粒含藥血清對各蛋白的影響,結果示藥物僅在高濃度時對p22ph (?)x、GTP-Racl及ROS表達量有輕度的抑制作用且不明顯(P0.05),低中濃度潛陽育陰顆粒含藥血清對各蛋白的影響與AngⅡ組相比均沒有統(tǒng)計學意義(P0.05),RT-PCR結果與Western Blot結果一致；⑦采用RNA干擾技術抑制TLR2的活性,檢測了含量明顯下降(P0.01),其中TLR2下降79.4%；造模成功后而加入潛陽育陰顆粒含藥血清干預后結果亦可再次抑制TLR4、MyD88的表達量(P0.01),并且抑制程度與陽性藥組相當；⑧在抑制NOX4的基礎上再次檢測了IL-6、TNF-α及NF-κB P65的蛋白表達量,結果發(fā)現(xiàn)而潛陽育陰顆粒干預后僅高濃度的潛陽育陰顆粒含藥血清對NF-κB P65及IL-6有輕度的抑制作用(P0.05),其余濃度均對下游炎癥因子無明顯影響(P0.05),可能為主要作用機制。而不同的是我們抑制TLR2的基礎上同樣再次檢測了IL-6、TNF-α及 NF-κB P65的蛋白表達量,發(fā)現(xiàn)潛陽育陰顆粒含藥血清干預也可再次抑制炎癥因子IL-6、TNF-α、 NF-κB P65的表達量(P0.01),說明TLR2不是主要靶點,僅起部分作用。結論：1.潛陽育陰顆粒主要通過干預AngⅡ/NOX4/ROS通路減少NOX4,Racl和p22phox表達,調控NF-κB信號通路,有效抑制下游IL-6及TNF-α等炎癥因子上調造成的ECM沉積,從而改善腎損害,起到一種抗氧化或炎癥抑制劑的作用；2.潛陽育陰顆�？赡懿糠滞ㄟ^阻斷TLR2/4/MyD88言號通路,有效抑制TLR2、TLR4及MyD88的大量產(chǎn)生和炎癥因子的釋放,改善腎損害,也可能起到一種炎癥抑制劑的作用；3.潛陽育陰顆粒具有多靶點改善高血壓形成的腎纖維化及腎損害的作用。4.潛陽育陰顆粒和貝那普利主要作用機制可能不同,聯(lián)合可從多方面保護腎臟,起到協(xié)同作用,有利于指導臨床用藥。5.潛陽育陰顆粒各劑量組之間呈一定的劑量依耐性,在大劑量時抑制氧化應激及炎癥反應的作用更加明顯,可作為臨床用藥劑量調整的基礎。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R259
【目錄】：

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本文編號：200606