發(fā)布時間：2018-03-09 11:01

  本文選題：口蹄疫病毒　切入點：CD44　出處：《長江大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引發(fā)的能夠感染偶蹄動物的一種高致病性傳染病。該病在全球范圍內(nèi)流行,對畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。研究FMDV的致病機理,對于開發(fā)新型有效的FMD防控方法具有重要作用。本課題前期利用SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法,發(fā)現(xiàn)在FMDV感染早期,CD44的表達量顯著上調(diào)。為了進一步研究CD44在FMDV感染中的作用機理,本研究主要做了以下幾方面的工作:為確定CD44對FMDV感染的影響,本研究利用Asia1型FMDV感染BHK-21細胞,利用Western blot和RT-PCR方法檢測內(nèi)源性CD44的表達變化,并利用激光共聚焦顯微鏡觀察CD44與FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的共定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FMDV感染能促進細胞內(nèi)源性CD44的表達,并且激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)FMDV可以與細胞膜表面的CD44發(fā)生共定位。為了進一步研究FMDV與CD44的關(guān)系,本研究利用MβCD抑制劑和siRNA干擾CD44的表達,利用Western blot、TCID50和RT-PCR方法分別檢測FDMV結(jié)構(gòu)蛋白表達、病毒滴度變化和病毒基因組拷貝變化,發(fā)現(xiàn)抑制CD44表達能夠抑制FMDV復(fù)制,此外,利用構(gòu)建真核表達載體過表達CD44后,利用Western blot、TCID50和RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn),過表達CD44能夠促進FMDV增殖,這些結(jié)果表明CD44參與FMDV的感染過程。先前研究表明,FMDV利用巨胞飲途徑進入宿主細胞,FMDV入侵細胞早期,首先結(jié)合并激活受體酪氨酸激酶RTKs,RTKs活化后,可激活細胞內(nèi)的肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白和其他一些蛋白因子,包括p-αPAK、FGF、FLT3、Rac1,導(dǎo)致細胞內(nèi)的肌動蛋白發(fā)生瞬時性解聚,并在細胞膜表面形成皺褶。為了研究CD44是否參與FMDV的巨胞飲作用,本研究將CD44干擾或過表達,利用Western blot方法研究發(fā)現(xiàn)p-αPAK、FGF、FLT3、P-Rac1、Rac1蛋白的表達變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CD44促進p-αPAK、FGF、FLT3、P-Rac1、Rac1蛋白的表達,表明CD44表達與p-αPAK、FGF、FLT3、P-Rac1、Rac1蛋白的表達具有協(xié)同作用。為了進一步驗證CD44是否參與RTKs通路,通過巨胞飲途徑感染宿主細胞,本研究利用特異性的RTKs抑制劑genistein(Gen)處理BHK-21細胞,Western blot檢測CD44的表達變化,結(jié)果表明CD44參與RTKs通路,通過巨胞飲途徑感染宿主細胞�？傊�,本研究通過探索CD44在口蹄疫病毒感染中的作用,進一步揭示了FMDV的感染機制,為開發(fā)阻斷FMDV入侵的藥物和高效疫苗提供新靶點。
[Abstract]:Foot-and-mouth disease (FMDV) is a highly pathogenic infectious disease caused by foot-and-mouth disease virus (FMDV). The disease is prevalent in the world and causes huge economic losses to animal husbandry. It was found that the expression of CD44 was significantly up-regulated in the early stage of FMDV infection by using SILAC quantitative proteomics method. In order to further study the mechanism of CD44 in FMDV infection, it was found that the expression of CD44 was significantly up-regulated in the early stage of FMDV infection. In order to determine the effect of CD44 on FMDV infection, we used Asia1 type FMDV to infect BHK-21 cells, and used Western blot and RT-PCR methods to detect the expression of endogenous CD44. The co-localization of CD44 and FMDV structural proteins was observed by laser confocal microscopy. The results showed that FMDV infection could promote the expression of endogenous CD44. In order to further study the relationship between FMDV and CD44, we used M 尾 CD inhibitor and siRNA to interfere the expression of CD44. The expression of FDMV structural protein, viral titer and viral genome copy changes were detected by Western blottit TCID50 and RT-PCR, respectively. It was found that inhibition of CD44 expression could inhibit FMDV replication. In addition, eukaryotic expression vector was used to express CD44. Using Western blottir TCID50 and RT-PCR methods, it was found that overexpression of CD44 could promote the proliferation of FMDV, which suggested that CD44 was involved in the process of FMDV infection. After the activation of the receptor tyrosine kinase, RTKsN RTKs, actin regulatory proteins and other protein factors, including p- 偽 PAKN FGFFGFFLT3 Rac1, were activated, which led to transient depolymerization of actin in cells. In order to study whether CD44 is involved in the giant cell drink of FMDV, CD44 was interfered or overexpressed by Western blot method. The expression of p- 偽 PAKN FGFFGF3, P-Rac1Rac1 was detected by Western blot method. The results showed that CD44 promoted the expression of p- 偽 PAKT FGFFLT3P-Rac1Rac1 protein, and the expression of pPAK- 偽 PAKG FGFFLT3P-Rac1Rac1 protein was also detected by Western blot method, and the results showed that p- 偽 PAKT FGFFLT3P-Rac1Rac1 protein was increased. The results indicated that the expression of CD44 was synergistic with the expression of p- 偽 PAKGF-FLT3FLT3, P-Rac1Rac1 protein. In order to further verify whether CD44 participated in the RTKs pathway, the host cells were infected by the megalocytic pathway. In this study, BHK-21 cells were treated with specific RTKs inhibitor genistein Genin to detect the expression of CD44 by Western blot. The results showed that CD44 participated in the RTKs pathway and infected host cells through the megalocytic pathway. By exploring the role of CD44 in the infection of foot-and-mouth disease virus (FMDV), this study further revealed the mechanism of FMDV infection, and provided a new target for the development of drugs to block the invasion of FMDV and efficient vaccine.
【學(xué)位授予單位】：長江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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本文編號：1588239