發(fā)布時間：2019-07-13 15:57

【摘要】：流行性乙型腦炎,又稱日本乙型腦炎,是一種由蟲媒介導(dǎo)傳播的人獸共患病。給人類健康和生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害,接種疫苗是防治該病的主要手段。目前國內(nèi)豬乙型腦炎疫苗毒株都是基因Ⅲ型,隨著優(yōu)勢基因型從Ⅲ型逐步轉(zhuǎn)換成Ⅰ型,開發(fā)基因Ⅰ型疫苗顯得尤為迫切,本研究是通過制備基因Ⅰ型乙型腦炎病毒滅活苗,篩選出具有優(yōu)秀免疫原性的候選毒株。成功制備出了滅活苗,并通過小鼠免疫試驗、豚鼠免疫試驗、小鼠攻毒保護試驗和仔豬免疫試驗初步篩選出兩株免疫原性較好的毒株。1.分離株的鑒定和毒株初步篩選1)分離株生物學(xué)特征研究:通過對病毒的復(fù)蘇,得到能夠穩(wěn)定傳代的四株(YA1、YA2、MY]、CZ1株)病毒,經(jīng)過RT-PCR鑒定為乙型腦炎病毒。在BHK-21細胞和鼠腦傳代制備出了不同的病毒液,通過測定四種毒株的TCID50和LD50發(fā)現(xiàn)鼠腦傳代后的病毒TCID50顯著升高,LD50顯著下降。病毒在BHK-21細胞傳達后滴度在104.6-105.8TCID50/0.2ml之間,鼠腦傳代后病毒滴度顯著上升,達到1011.8-1012.3TCID50/0.2ml,細胞傳代后半數(shù)致死量在10-3.5-10-4.2/0.025ml之間,鼠腦傳代后半數(shù)致死量顯著下降,LD50在10-7.3-10-6.3/0.025ml之間,因此選擇鼠腦病毒液作為制備滅活苗的病毒液。2)滅活苗的制備:將制備好的鼠腦病毒液通過甲醛滅活,通過滅活條件的優(yōu)化實驗,確立了 0.05%甲醛在37℃滅活48h的最佳滅活條件,通過劑型檢驗、穩(wěn)定性檢驗、無菌檢驗和安全性檢驗制備出了質(zhì)量合格的四種毒株鼠腦滅活苗。3)毒株初步篩選:在制備出合格疫苗的基礎(chǔ)上,開展小鼠免疫試驗,通過腹腔接種后監(jiān)測小鼠血清JEV抗體水平,初步篩選免疫原性較好的毒株。結(jié)果顯示四種毒株制備的疫苗都具有良好的免疫原性,在二免后兩周YA1株和CZ1株組的小鼠抗體水平顯著高于商品化滅活苗組(P0.01),在二免后4周所有分離株組的小鼠抗體水平都顯著高于商品化滅活苗組(P0.01),但在絕對數(shù)值上YA1株和CZ1株組小鼠抗體水平更高,初步篩選出免疫原性較優(yōu)的YA1株和CZ1株。2.候選毒株免疫原性研究1)豚鼠免疫試驗:在初步篩選出YA1株和CZ1株后,開展了豚鼠免疫試驗進一步評價了兩毒株作為豬乙型腦炎滅活苗候選毒株的可能性,豚鼠試驗顯示CZ1株和YA1株都能使100%的豚鼠產(chǎn)生合格的血凝抑制抗體,相對于商品化滅活苗陽性轉(zhuǎn)化率更高、血凝抑制抗體效價也更高,二者之間CZ1株組豚鼠產(chǎn)生的血凝抑制抗體水平顯著高于YA1株組(P0.05)。2)小鼠攻毒保護試驗:疫苗在免疫3周齡小鼠后1周加強免疫一次,二免后1周使用1OLD50腦內(nèi)攻毒,結(jié)果顯示YA1株疫苗對小鼠的保護率為70%,CZ1株疫苗對小鼠的保護率為80%,而商品化的鼠腦滅活苗和減毒活疫苗的保護率分別為60%和70%。兩毒株都顯示出了優(yōu)良的保護力,CZ1株的保護力則更優(yōu)。3)仔豬免疫試驗:仔豬免疫試驗結(jié)果顯示兩個毒株都能使仔豬的抗體陽性轉(zhuǎn)化率達到100%,相對于商品化滅活苗抗體水平和中和抗體效價更高。同時抗體水平與前文的豚鼠免疫試驗、小鼠攻毒保護試驗結(jié)果相符,二者之間CZ1株的免疫原性更好。
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圖片說明： 圖３．２邋４株病毒ＲＴ－ＰＣＲ檢測逡逑ｉｇ．３．２邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ邋ｖｉｒｕｓ邋ｓｔｒａｉｎｓ逡逑ｌｌ；邋１邋？４邋分別為邋ＹＡ１、ＹＡ２、ＭＹ１、ＣＺ１邋株邋ＲＴ－ＰＣＲ邋檢測結(jié)果；逡逑５．空白對照組；７．陽性對照組逡逑１－４．ＲＴ－ＰＣＲ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＹＡ１，ＹＡ２，ＭＹ１邋ａｎｄ邋ＣＺ１邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；邋５．邋Ｂｌａｎｋ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋；邋６．邋Ｔｈｅ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑
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圖片說明： Ｆｉｇ邋３．４邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｆｉｖｅ邋ｋｉｎｄｓ邋ｏｆ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ逡逑４討論逡逑目前預(yù)防豬乙型腦炎病毒的疫苗主要是減毒活疫苗，該疫苗毒株為人用疫苗毒逡逑株，為基因ＩＩＩ型病毒，而國內(nèi)乙型腦炎優(yōu)勢基因型已經(jīng)從ＩＩＩ型轉(zhuǎn)變?yōu)椋毙停郏保玻�，同時逡逑又有研宄指出，免疫基因ＩＩＩ型疫苗只能對部分基因Ｉ型病毒產(chǎn)生保護力［６５］。在此背逡逑景下，研制出安全、有效的基因Ｉ型豬乙型腦炎滅活苗顯得尤為迫切。逡逑本研宄使用的四個毒株都是基因Ｉ型病毒，，ＹＡｌ、ＹＡ２、ＭＹ１為豬源毒株，ＣＺ１逡逑為蚊源毒株。在ＢＨＫ－２１細胞上都能穩(wěn)定傳代，但是病毒的滴度（ＴＣＩＤ５Ｇ）較低，逡逑同時對乳鼠的半數(shù)致死量（ＬＤ５0）也較高，因此ＢＨＫ－２１細胞病毒液不能作為疫苗逡逑生產(chǎn)用病毒液。將病毒經(jīng)過鼠腦傳代后，病毒滴度都有了較大的提升，乳鼠半數(shù)致逡逑死量大幅降低。由于乳鼠為其敏感試驗動物，乳鼠腦內(nèi)接種相對于ＢＨＫ－２１細胞接逡逑
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4

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本文編號：2514106