發(fā)布時(shí)間：2020-11-12 10:09

　　 目的:沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)為第III類組蛋白去乙�；�酶家族的一員,研究表明SIRT1在多種腫瘤中呈異常表達(dá)并與腫瘤的耐藥密切相關(guān)。本研究通過細(xì)胞水平研究靶向SIRT1的小干擾RNA對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響,探討其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。在此基礎(chǔ)上將siRNA-SIRT1與順鉑聯(lián)合作用Hela細(xì)胞,檢測(cè)SIRT1對(duì)相關(guān)耐藥基因的影響。方法:化學(xué)合成靶向SIRT1的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)及其陰性對(duì)照序列,應(yīng)用Lipofectamine RNAi MAX脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為三組:空白細(xì)胞對(duì)照組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組和siRNA-SIRT1轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染72h后,分別提取各組細(xì)胞總RNA和總蛋白。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中SIRT1 mRNA的表達(dá);免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá)。采用siRNA轉(zhuǎn)染和順鉑藥物聯(lián)合作用Hela細(xì)胞,CCK-8法測(cè)定Hela細(xì)胞的增殖及順鉑對(duì)Hela的IC_(50)值;RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)Hela細(xì)胞ABCC1和ABCG2 mRNA的表達(dá);免疫印跡法檢測(cè)Hela細(xì)胞ABCC1蛋白的表達(dá)水平;Transwell小室分別檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡。結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照siRNA組和空白細(xì)胞對(duì)照組相比,siRNA-SIRT1組SIRT1 mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)(P0.05)。免疫印跡結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照siRNA組和空白對(duì)照組相比,siRNA-SIRT1組SIRT1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05)。CCK-8結(jié)果顯示:順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的IC_(50)值分別為5.34μM(24h)和3.70μM(48h)。siRNA-SIRT1與順鉑聯(lián)合作用組中順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的IC_(50)為1.58μM(24h),明顯低于單獨(dú)順鉑作用組。siRNA-SIRT1組細(xì)胞增殖抑制率為28.6%,而陰性對(duì)照si RNA組細(xì)胞增殖抑制率為6.3%,空白細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率為4.7%。si RNA-SIRT1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于其他對(duì)照組(P0.05)。RT-PCR和qRT-PCR結(jié)果均顯示:與陰性對(duì)照siRNA組和空白對(duì)照組相比,siRNA-SIRT1組ABCC1mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05),而ABCG2表達(dá)無顯著性差異。免疫印跡結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照siRNA組和空白對(duì)照組相比,siRNA-SIRT1組ABCC1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05)。與陰性對(duì)照siRNA和順鉑聯(lián)合作用組及空白對(duì)照和順鉑聯(lián)合作用組相比,siRNA-SIRT1轉(zhuǎn)染和順鉑聯(lián)合作用組的ABCC1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05)。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:siRNA-SIRT1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲能力均明顯高于其他對(duì)照組(P0.05)。流式檢測(cè)結(jié)果表明:空白細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞的早期凋亡率為2.9%,陰性siRNA對(duì)照組細(xì)胞的早期凋亡率為3.7%,siRNA-SIRT1組的細(xì)胞早期凋亡率為11.7%。與陰性對(duì)照si RNA組和空白細(xì)胞對(duì)照組相比,siRNA-SIRT1組細(xì)胞的早期凋亡率明顯提高(P0.05)。結(jié)論:siRNA-SIRT1不僅能抑制宮頸癌發(fā)生細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而且可以下調(diào)耐藥基因ABCC1的表達(dá),其與順鉑的聯(lián)合作用可以通過降低耐藥基因ABCC1表達(dá)進(jìn)而提高Hela細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。SIRT1有望通過影響ABCC1的表達(dá)進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)宮頸癌的化療耐藥。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

結(jié)果結(jié) 果 Hela 細(xì)胞 SIRT1 表達(dá)的影響ela 細(xì)胞 SIRT1 mRNA 水平實(shí)驗(yàn)，選擇最佳轉(zhuǎn)染濃度為 30nM 的小干陰性對(duì)照 siRNA 組和空白細(xì)胞對(duì)照組均顯對(duì)照組及空白細(xì)胞對(duì)照組相比，siRNA-SIRT降（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖 1。

12圖 2. siRNA-SIRT1 對(duì) SIRT1 蛋白的表達(dá)的影響. Effects of siRNA-SIRT1 on the expressions of SIRT1 proestern blot 結(jié)果； B：Western blot 檢測(cè) SIRT1 灰度值對(duì)照 siRNA 轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組相比，***P<0.0001

結(jié)果-SIRT1 對(duì) Hela 細(xì)胞增殖及順鉑 IC50的影響-8 結(jié)果顯示：siRNA-SIRT1 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率為 28.6%，細(xì)胞的增殖抑制率為 6.3%，空白細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率為 siRNA 組和空白對(duì)照組相比，siRNA-SIRT1 組細(xì)胞的增殖抑制率計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。測(cè)得順鉑對(duì) Hela 細(xì)胞 24h 的 IC50為 5.34μMM。siRNA-SIRT1 與順鉑聯(lián)合作用，測(cè)得順鉑對(duì) Hela 細(xì)胞 24h 與單獨(dú)順鉑作用相比，siRNA-SIRT1 與順鉑聯(lián)合作用組細(xì)胞的 I 3。
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本文編號(hào)：2880617