發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 05:37

　　 研究背景及目的:卵巢癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤,起病隱匿,死亡率高。嚴(yán)重威脅是女性健康。與正常組織相比較,ATF4在腫瘤組織中的表達(dá)高,腫瘤微環(huán)境(如缺氧/無(wú)氧、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等)信號(hào)可以上調(diào)其表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn),ATF4與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移,侵襲和耐藥等信號(hào)通路有關(guān)。ATF4能夠與VEGF-A、uPA基因的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合,增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性來(lái)上調(diào)二者表達(dá);而目前表明VEGF-A和uPA基因在卵巢癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著十分重要的作用。核糖體蛋白R(shí)PL41(Ribosomal protein L41,RPL41),由25個(gè)氨基酸組成小分子多肽。目前研究表明rpl41表達(dá)的下調(diào)與多種腫瘤細(xì)胞有關(guān)。課題組前期研究表明RPL41能夠誘導(dǎo)ATF4磷酸化,轉(zhuǎn)移到蛋白酶體內(nèi)迅速降解。而RPL41分子量小,可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜,具有成為藥物的先天優(yōu)勢(shì)。在本次研究中,我們使用小分子胎RPL41誘導(dǎo)ATF4表達(dá)下調(diào),探討RPL41對(duì)于卵巢癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制,在為卵巢癌的治療提供新的靶點(diǎn)。研究方法:1.RPL41對(duì)OC細(xì)胞系A(chǔ)2780及CAOV3細(xì)胞的抑制作用,并觀察RPL41引起卵巢癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變以及對(duì)OC細(xì)胞周期的影響(1)利用CellTiter-Glo?熒光細(xì)胞活性檢測(cè)系統(tǒng)觀察RPL41對(duì)細(xì)胞的作用。(2)采用Hoechst熒光染色法觀察A2780及CAOV3細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。(3)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度RPL41干預(yù)后,A2780細(xì)胞、CAOV3細(xì)胞細(xì)胞周期與凋亡情況2.細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)研究RPL41對(duì)A2780及CAOV3細(xì)胞的遷移及侵襲能力的影響。(1).細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察RPL41對(duì)A2780細(xì)胞、CAOV3細(xì)胞遷移能力的影響(2)侵襲小室實(shí)驗(yàn)觀察RPL41對(duì)A2780細(xì)胞、CAOV3細(xì)胞侵襲能力的影響3.研究RPL41抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。(1).雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)研究卵巢癌細(xì)胞中ATF4對(duì)VEGF-A和uPA啟動(dòng)子的調(diào)控作用。(2).應(yīng)用Western blot及RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證RPL41誘導(dǎo)的ATF4降解是否能夠下調(diào)VEGF-A及uPA基因的表達(dá)。結(jié)果:Hoechst熒光染色及Annexin-V/Pl雙染檢測(cè)A2780細(xì)胞、CAOV3細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:不同濃度RPL41作用24h后,隨著RPL41作用濃度的增加,細(xì)胞凋亡率增加,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變,在RPL41濃度大于100μM時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。而作用48h后,細(xì)胞凋亡趨勢(shì)并不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CellTiter-Glo?實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)胞活性隨著RPL41作用濃度的增加,作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。劃痕實(shí)驗(yàn)及侵襲小室實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明RPL41可以有效抑制卵巢癌細(xì)胞A2780、CAOV3的遷移和侵襲能力,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng),研究結(jié)果顯示ATF4對(duì)VEGF-A和uPA啟動(dòng)子具有調(diào)控作用,而Western blot及RT-PCR結(jié)果顯示:ATF4,VEGF-A和uPA隨著RPL41濃度的增高,表達(dá)降低。結(jié)論:1.RPL41誘導(dǎo)OC細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)學(xué)變化,抑制其生長(zhǎng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并且作用于G2-M期。2.RPL41抑制A2780及CAOV3細(xì)胞的遷移及侵襲能力3.RPL41誘導(dǎo)ATF4下調(diào),進(jìn)而對(duì)VEGF-A及uPA啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控4.RPL41可以作為敲低ATF4的媒介
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R737.31
【部分圖文】：

圖 1. Hoechst 檢測(cè) CAOV3 及 A2780 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化A: 24h 時(shí)，A2780 細(xì)胞隨著 RPL41 濃度的升高而出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂，濃度越高明顯，存在計(jì)量依賴(lài)性。而 48 小時(shí)也出現(xiàn)和碎裂現(xiàn)象，但無(wú)明顯計(jì)量依賴(lài)性CAOV3 細(xì)胞隨著 RPL41 濃度的升高而出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂，濃度越高，細(xì)胞凋亡計(jì)量依賴(lài)性。而 48 小時(shí)也出現(xiàn)和碎裂現(xiàn)象，但無(wú)明顯計(jì)量依賴(lài)性。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文.3 Annexin V /PI 雙熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡與周期結(jié)果本實(shí)驗(yàn)采用 Annexin V /PI 雙熒光染色的法來(lái)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的凋亡情況結(jié)果顯示： 在 RPL41 濃度分別為 0，20，40，60，80，100μM 時(shí)，在作用時(shí)的凋亡率分別為：8.5，8.15，17.2，17.42，20.61and 22.03%。而在 RPL41 8 小時(shí)的凋亡率確是：6.5，6.6，7.88，9.74，10.14 and 12.38%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 24 小時(shí)的時(shí)候，隨著 RPL41 濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率是隨之增加的，且大于 100 μM 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05), 在 48 小時(shí)的時(shí)候，細(xì)胞的凋亡率4 小時(shí)反而降低，且組間未見(jiàn)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （圖.3）

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文4.5 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) RPL41 對(duì) CAOV3 及 A2780 細(xì)胞侵襲能力的抑制能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)對(duì)照組細(xì)胞侵襲能力較強(qiáng)，而 RPL41 作用組，細(xì)胞侵襲能力相對(duì)較弱。且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這表明 RPL41 對(duì)卵巢癌細(xì)胞 CAOV3 及 A2780力具有抑制作用（如圖：5）。
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本文編號(hào)：2888373