發(fā)布時間：2020-11-04 02:21

　　 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是多種細胞(如嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組份(cellular elements)參與的慢性氣道炎癥性疾病,伴有氣道高反應性、氣道阻塞和氣道重塑。哮喘患病率在全球范圍內有逐年增加的趨勢,目前全球至少有3億以上,我國有近3000萬哮喘患者,哮喘已成為僅次于癌癥的世界第2大致死和致殘疾病,嚴重危害人類健康。哮喘是一種基因和環(huán)境因素相互作用導致的復雜疾病,即使在今天生物-環(huán)境-心理的疾病評估模式中,其發(fā)病、發(fā)展等環(huán)節(jié)仍不清楚。因此探討哮喘發(fā)病機制、尋找新的治療乃至預防靶點仍然是哮喘研究的重大課題。 隨著研究的不斷拓展和深入,關于哮喘發(fā)病的假說不斷增多,其中氣道上皮結構、功能受損和免疫作用異常成為研究熱點,氣道上皮在哮喘發(fā)病中的地位被大大提升。目前認為氣道上皮細胞是哮喘發(fā)病關鍵環(huán)節(jié)。氣道上皮正常情況處于免疫耐受狀態(tài),是機體抵抗氣道內外環(huán)境有害刺激的第一道屏障。上皮細胞維持正常結構及功能,需要相鄰細胞通過不同連接蛋白及信號分子形成緊密連接、粘附連接及橋粒連接,并通過連接蛋白協(xié)調表達和相互作用,保持上皮細胞結構的完整及極性,調節(jié)物質轉運。緊密連接位于氣道上皮頂端,由occludin及claudin蛋白家族構成,主要負責調控旁細胞通透性以及維持上皮極性。緊靠緊密連接下方是粘附連接,是由Ca2+依賴的E-cadherin以及與E-cadherin相結合的多種連環(huán)蛋白(如a、p連環(huán)蛋白)和肌動蛋白細胞骨架相互作用形成的,E-cadherin具有負性免疫調控作用,與上皮免疫耐受有關。般認為,粘附連接是緊密連接形成的前提,它的形成活化了細胞內多種有活性的蛋白質分子,最終導致緊密連接相關蛋白聚集于相鄰細胞接觸部位,形成一個完整的頂端連接復合體。 氣道上皮細胞不但參與氣道上皮物理屏障的形成,而且通過分泌多種活性物質發(fā)揮免疫調節(jié)作用。氣道上皮細胞表面及胞漿中存在模式識別受體(PRRs),主要為Toll樣受體(TLRs)和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)。模式識別受體(PRRs)被激活后,經(jīng)過一系列銜接蛋白的信號轉導后,激活NF-κB或IRF-3/7等轉錄調節(jié)因子,調節(jié)相關效應分子的基因轉錄,最終表現(xiàn)為抗菌蛋白、干擾素、促炎因子、趨化因子的產(chǎn)生和釋放,參與哮喘慢性氣道炎癥的啟動和維持。 當哮喘發(fā)病時,氣道上皮及固有免疫細胞可釋放以高遷移率族蛋白1(HMGB1)為代表的DAMP(損傷相關分子模式)分子,進而啟動氣道固有免疫及獲得性免疫,打破氣道上皮免疫耐受,釋放更多炎癥介質,炎癥介質相互作用于氣道上皮,形成復雜細胞因子調節(jié)網(wǎng)絡,引發(fā)和促進哮喘發(fā)生。因此,炎癥介質致氣道上皮功能失調是促發(fā)和維持哮喘發(fā)病的重要機制之一。 高遷移率族蛋白(HMGB1)是真核細胞大量存在的一種染色體結合蛋白,廣泛分布于淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等組織中,其基本功能參與調控DNA重組、修復、復制和基因轉錄。正常情況下肺組織HMGB1主要位于結構細胞核中,處于低表達水平,但對維持肺及氣道的正常生理功能具有重要作用。近年來在動物模型和人類疾病的研究上發(fā)現(xiàn)：HMGB1可釋放到胞外,發(fā)揮促炎因子的功能。HMGB1可以從激活的免疫細胞如單核巨噬細胞中釋放出來,也能夠從損傷和壞死的細胞被動釋放出來。HMGB1可以誘導許多炎癥因子如TNF-α,IL-1, IL-6和IL-8等的釋放,也能激活人內皮細胞,導致其粘附分子的表達上調。因此,HMGB1作為一種重要上游免疫調節(jié)因子,當細胞損傷后其釋放出細胞外,會激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥反應。 HMGB1是一種重要的炎癥介質,與膿毒癥、免疫性疾病、惡性腫瘤等疾病相關,近期研究顯示HMGB1可能參與多個呼吸系統(tǒng)疾病的病理生理過程,在哮喘等慢性炎癥氣道疾病的地位也越來越受到人們的重視。 當氣道上皮細胞受到過敏原、微生物等有害因素攻擊而受損時,根據(jù)Matzinger的危險模式理論,可產(chǎn)生某些內源性危險信號分子,也就是DAMPs分子,又稱警報素(alarmin)。HMGB1是DAMPs家族的重要組成成分之一。氣道上皮受到有害因素攻擊后,HMGB1可由胞核釋放到胞外,與Toll樣受體(TLRs)、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)等膜受體結合,引起前炎癥因子IL-1釋放,刺激機體固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生防御反應及組織修復。釋放到胞外的HMGB1其本身也能夠誘導單核／巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等獲得性免疫細胞合成并分泌TNF-α、INF-γ及IL-1β等炎癥介質,這些炎癥介質又能夠加強HMGB1的分泌效應,從而形成一個復雜的細胞因子分泌調節(jié)網(wǎng)絡。這說明以HMGB1為代表的DAMPs分子在氣道炎癥過程致敏階段固有免疫向獲得性免疫轉化中起重要作用,是調控TNF-α、INF-y及IL-1β等炎癥介質的關鍵上游分子。 本實驗室早期,在卵蛋白(OVA)誘導的小鼠哮喘模型觀察到肺組織及肺泡灌洗液HMGB1表達顯著升高。我們進一步研究也發(fā)現(xiàn),哮喘患者誘導痰及血漿中HMGB1水平顯著升高,且誘導痰HMGB1水平與肺功能指標顯著負相關,這提示HMGB1參與哮喘氣道炎癥。為進一步評價HMGB1在哮喘發(fā)病中作用,韓國學者在OVA誘導的小鼠哮喘模型阻斷HMGB1活性,發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低氣道高反應性,改善氣道局部炎癥反應及病理改變。2013年最新研究表明HMGB1受體RAGE缺失的小鼠,顯著減少屋塵螨(HDM)致哮喘Th2型細胞因子表達,氣道嗜酸性粒細胞浸潤以及血漿IgE水平,這一發(fā)現(xiàn)使得HMGB1-RAGE受體軸在哮喘發(fā)病的重要作用愈發(fā)受人關注。據(jù)此,我們認為DAMPs分子-HMGB1是參與哮喘發(fā)病的重要炎癥介質,可能是一種新的哮喘慢性氣道炎癥調控機制。 我們已證實,哮喘患者誘導痰及血清中HMGB1水平顯著上調,且與疾病嚴重程度相關,提示HMGB1是參與哮喘發(fā)生、發(fā)展過程重要炎癥介質。目前,關于哮喘氣道上皮功能失調的研究主要集中在TNF-α、IFN-γ及IL-1β等下游炎癥介質的致傷作用,而對于調控TNF-α、IFN-γ及IL-1β的關鍵上游DAMPs分子-HMGB1對氣道上皮功能的影響及調節(jié)機制研究相對較少,有必要深入的研究。 目的： 1.探討HMGB1致氣道上皮屏障功能損傷作用及可能參與的信號轉導調節(jié)機制； 2.進一步明確HMGB1協(xié)同IL-1β是否對氣道上皮屏障功能損傷有促進作用； 方法： 1.培養(yǎng)氣道上皮細胞株16-HBE及A-549。 2.MTT比色法檢測HMGB1對氣道上皮細胞株16-HBE及A-549細胞活力的影響：選取不同濃度(100、200、400和800ng/ml) HMGB1與16-HBE及A-549細胞共培養(yǎng),MTT比色法檢測細胞活力。 3.觀察HMGB1對氣道上皮屏障功能的損傷作用-劑量效應實驗。不同濃度(100.200、400ng/ml) HMGB1刺激16-HBE及A-549氣道上皮細胞株24h,觀察其對氣道上皮屏障功能損傷作用,屏障功能觀察指標主要有： ①單層氣道上皮細胞通透性檢測：Transwell技術檢測單層16-HBE及A-549細胞跨膜電阻值(TER)以及FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)的改變。 ②Western bolt方法檢測緊密連接蛋白(occludin和claudin-2)及粘附連接蛋白(E-cadherin和β-catenin)表達情況； ③免疫熒光化學方法檢測緊密連接蛋白(occludin和claudin-2)或粘附連接蛋白(E-cadherin和β-catenin)分布情況； 4.觀察HMGB1對氣道上皮屏障功能的損傷作用-時間效應實驗。400ng/ml HMGB1在不同時間點(0、1、3、6、12、24和48h)刺激16-HBE和A-549細胞,觀察其對氣道上皮屏障功能的損傷作用,屏障功能觀察指標參照方法3； 5.觀察HMGB1協(xié)同IL-1β對氣道上皮屏障功能損傷的作用。實驗分為4組：①對照組；②單獨IIMGB1(100ng/ml)刺激組；③單獨IL-1β (2.5ng/ml)刺激組；④HMGB1(100ng/ml)/IL-1β (2.5ng/ml)聯(lián)合刺激組。按上述分組處理16-HBE細胞24h,觀察其對氣道上皮屏障功能損傷作用,屏障功能觀察指標參照方法3； 6.評價連接蛋白occludin在HMGB1致氣道上皮屏障功能損傷中的作用：構建含野生型全長occludin基因質粒,擴增、提取并鑒定質粒。應用堿裂解法提取目的質粒,采用瓊脂凝膠電泳和DNA測序鑒定目的基因,并測定滴度。應用陽離子脂質體法分別將occludin基因轉染氣道上皮細胞并過表occludin蛋白,通過倒置熒光顯微鏡觀察GFP情況以了解轉染效率,再應用QPCR和Western bolt技術確定有效的基因轉染；轉染16-HBE細胞。 ①檢測過表達occludin蛋白對跨膜電阻(TER)、FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)以及其他連接蛋白表達的影響； ②評價連接蛋白occludin在HMGB1致氣道上皮屏障功能損傷中的作用：HMGB1(400ng/ml)分別刺激過表達和正常表達occludin蛋白的16-HBE細胞；實驗分為4組：正常表達組(未轉染occlduin基因正常細胞),過表達組(轉染并過表達occlduin蛋白的16-HBE細胞),正常表達+HMGB1刺激組(HMGB1刺激正常表達occludin蛋白的16-HBE細胞24h)和過表達+HMGB1刺激組(HMGB1刺激過表達occludin蛋白的16-HBE細胞24h)。按照分組給予相應處理后,觀察和比較跨膜電阻值(TER)及FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)的變化。7.探討參與HMGB1致氣道上皮屏障功能損傷作用的信號通路。觀察HMGB1致氣道上皮屏障功能損傷過程中HMGB1受體(TLR2、TLR4及RAGE)蛋白表達水平變化,以及其下游MAPK信號通路活化情況。在上述實驗基礎上,選擇相應抗-膜受體單克隆抗體和MAPK信號通路阻斷劑,檢測其對跨膜電阻(TER)、FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)及連接蛋白的影響,發(fā)現(xiàn)參與HMGB1致氣道上皮屏障損傷的可能信號通路途徑。 結果： 1、與對照組比較,100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml HMGB1對細胞活力無明顯影響(P值均0.05,n=6),而濃度達到800ng/ml的HMGB1刺激細胞明顯降低細胞活力(P值均0.001,n=6)。 2, HMGB1對氣道上皮細胞株16HBE和A549屏障功能的影響：HMGB1可導致16HBE和A549單層細胞跨膜電阻值(TER)顯著下降和FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)顯著增加,跨膜電阻值(TER)和FITC右旋糖苷(FITC-DX)通透性改變呈時間劑量依賴效應。與對照組比較,分別給予100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml HMGB1刺激16HBE或A549細胞,均可導致跨膜電阻值(TER)下降和FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加,其中400ng/ml HMGB1引起改變最為顯著(P0.001)。在400ng/ml HMGB1刺激A549細胞6h或者16HBE細胞12h,即可觀察到跨膜電阻值(TER)下降,呈時間依賴關系(A549細胞：F=80.46,P0.001;16HBE細胞：F=49.62,P0.001)。與對照組比較,400ng/ml HMGB1刺激細胞12h、24h、48h均可導致FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加(P0.001),且呈時間依賴關系。與16HBE細胞比較,HMGB1刺激A549細胞對跨膜電阻值(TER)和FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)的改變更加顯著。 3、HMGB1對氣道上皮細胞株16HBE和A549連接蛋白表達及分布的影響： ①A549細胞：400ng/ml HMGB1刺激細胞12h后,緊密連接蛋白occludin和claudin-2表達水平顯著減少；而刺激細胞48h后粘附連接蛋白E-cadherin和β-catenin表達水平才顯著減少；刺激細胞48h對連接蛋白表達的影響最明顯。 ②16HBE細胞:400ng/ml HMGB1刺激細胞24h時,緊密連接蛋白occludin和claudin-2表達水平顯著減少,刺激細胞48h時蛋白水平進一步減少；而粘附連接蛋白E-cadherin和β-catenin表達水平無明顯變化。但免疫熒光定位顯示HMGB1可促進E-cadherin蛋白由胞膜向胞漿移位并破壞β-catenin細胞膜結構穩(wěn)定性。 4、緊密連接蛋白occludin參與HMGB1致氣道上皮屏障功能損傷作用：與正常表達occludin蛋白的16HBE細胞比較,過表達occludin蛋白導致16HBE細胞的跨膜電阻值(TER)增加、FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)減少,有統(tǒng)計學差異(P0.001),但過表達occludin蛋白對連接蛋白E-cadherin、β-catenin和claudin-2的表達水平無顯著影響；16HBE細胞過表達occludin蛋白可以顯著抑制HMGB1導致的氣道上皮屏障功能損傷[跨膜電阻值(TER)降低和對FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加],與HMB1刺激正常的16HBE細胞引起屏障功能損傷相比較,有統(tǒng)計學差異(P0.001,n=5)。 5、HMGB1協(xié)同IL-1β促進氣道上皮屏障功能損傷作用的結果： ①與對照組比較,單獨HMGB1(100ng/ml)刺激16HBE細胞24h,跨膜電阻值(TER)無明顯改變(P=0.091),但可增加FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)(P0.001)。與對照組及單獨HMGB1(100ng/ml)刺激比較,HMGB1(100ng/ml)協(xié)同IL-1β(2.5ng/ml)可顯著降低跨膜電阻值(TER)(P=0.002和P=0.04),并顯著增加FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)(P0.001); ②對連接蛋白表達及分布的影響：單獨HMGB1或IL-1β刺激對連接蛋白表達及分布無影響,HMGB1協(xié)同IL-1β顯著減少occludin及claudin-2蛋白的表達水平(P=0.004和P=0.001)；免疫熒光定位結果顯示HMGB1可促進E-cadherin蛋白由胞膜向胞漿移位,并破壞β-catenin細胞膜結構穩(wěn)定性。 6、RAGE/ERK信號通路參與HMGB1致氣道上皮屏障損傷及連接蛋白破壞： ①Western bolt結果顯示：HMGB1可顯著增加16HBE細胞RAGE蛋白表達水平,1h開始明顯增加,24減少至正常水平,而對TLR2和TLR4蛋白表達水平無影響；抗RAGE單克隆抗體預處理16HBE細胞1h,可部分抑制HMGB1引起跨膜電阻值(TER)下降及FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加(P=0.001和P=0.002)； ②HMGB1可引起16HBE細胞MAPK信號通路活化,分別在HMGB1刺激后6,7,5h可觀察到ERK、PI3K/akt及JN磷酸化水平明顯增加；使用ERK通路抑制劑(U0126)后,可以部分抑制HMGB1引起跨膜電阻值(TER)下降及FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加,而使用PI3K/akt和JNK信號通路抑制劑(LY294002和SP600125)并未觀察到類似效應； ③抗RAGE單克隆抗體能抑制HMGB1引起ERK磷酸化； ④使用ERK通路抑制劑(U0126)后能減少HMGB1引起16HBE細胞occludin及claudin-2蛋白的破壞,并抑制E-cadherin蛋白由胞膜向胞漿移位及β-catenin細胞膜結構的破壞。 結論： 1、HMGB1可導致氣道上皮細胞屏障功能損傷,主要表現(xiàn)為跨膜電阻值(TER)顯著下降和FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)顯著增加,這種損傷作用呈現(xiàn)為時間-劑量依賴效應；HMGB1協(xié)同IL-1p可以促進對氣道上皮屏障功能損傷 作用； 2、在HMGB1引起氣道上皮細胞屏障功能損傷同時,減少緊密蛋白occludin及claudin-2蛋白表達水平,其中緊密蛋白occludin在HMGB1引起氣道上皮細胞屏障功能損傷中發(fā)揮重要作用。此外HMGB1還可以促進粘附連接蛋白E-cadherin由胞膜向胞漿移位及破壞β-catenin細胞膜結構穩(wěn)定性。 3、HMGB1可能通過RAGE/ERK信號通路參與氣道上皮細胞屏障功能損傷,連接蛋白表達及分布異常；
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R562.25
【部分圖文】：

圖2.檢測上皮細胞通透性裝置-Transwell板結構示意圖Fig 2. Transwell structural skech map細胞按照2.5><104/cm2密度接種在12孔板transwell嵌套的濾膜上,培養(yǎng)3天后，細胞完全融合為單層,將培養(yǎng)基換成RPMI1640基礎培養(yǎng)基。每個板隨機抽三

圖2.檢測上皮細胞通透性裝置-Transwell板結構示意圖Fig 2. Transwell structural skech map細胞按照2.5><104/cm2密度接種在12孔板transwell嵌套的濾膜上,培養(yǎng)3天后，細胞完全融合為單層,將培養(yǎng)基換成RPMI1640基礎培養(yǎng)基。每個板隨機抽三

圖1-1. MTT比色法檢測不同濃度的HMGBl對氣道上皮細胞活力的影響（n=6)Fig .1-1 Effect of different concentrations of HMGBl on vitality of airway epithelial cell lines byMTT assay (n=6)28
【參考文獻】

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1 付亮;蔡紹曦;趙海金;李文軍;佟萬成;;N-乙酰半胱氨酸對哮喘小鼠肺組織HMGB1、RAGE表達的影響[J];南方醫(yī)科大學學報;2008年05期

2 侯長春;趙海金;李文軍;蔡紹曦;;過氧化氫誘導支氣管上皮細胞高遷移率族蛋白1主動釋放[J];南方醫(yī)科大學學報;2012年08期

3 張丹丹;趙海金;周麗芹;宋甲富;董航明;鄒飛;蔡紹曦;;高遷移率族蛋白B1協(xié)同白介素-1β可增加人氣道上皮細胞白介素-8的表達[J];南方醫(yī)科大學學報;2012年12期

本文編號：2869464