發(fā)布時間：2020-11-03 23:05

　　 肺纖維化是間質(zhì)性肺疾病的最終結(jié)局,目前尚無控制或逆轉(zhuǎn)病情的有效治療方法,肺移植是唯一可以延長肺纖維化患者生存期的方法,因其代價昂貴和供體稀缺,所以不能普遍開展。在現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)飛速發(fā)展的推動下,基因治療肺纖維化有望成為一種突破性的治療手段。 肺纖維化被認(rèn)為是局限于肺部的一種成纖維細(xì)胞增殖性疾病,上皮細(xì)胞受損直接導(dǎo)致肺纖維化形成,伴或不伴間質(zhì)炎癥,屬于上皮-成纖維細(xì)胞疾病。依據(jù)這個觀點,上皮細(xì)胞受損后發(fā)生上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖是肺纖維化形成的兩個主要環(huán)節(jié),那么,抑制上皮細(xì)胞EMT和后續(xù)增殖是治療肺纖維化的兩個有效靶點。 Napsin A是天門冬氨酸蛋白酶家族中的成員之一,在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中有明顯表達。研究發(fā)現(xiàn)它除了具有蛋白水解酶活性外,還有調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)行為的功能。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在表型發(fā)生轉(zhuǎn)化后,比如惡性轉(zhuǎn)化,Napsin A表達下調(diào),且下調(diào)幅度與表型轉(zhuǎn)化程度成正相關(guān),提示Napsin A的缺失可能是細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的原因之一,恢復(fù)Napsin A的表達或許可以逆轉(zhuǎn)這一過程。也有研究將Napsin A基因?qū)�入�?xì)胞DNA中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力在體內(nèi)外實驗中均受到抑制,Napsin A可以抑制細(xì)胞的增殖能力。本課題利用Napsin A抑制細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和增殖能力的生物學(xué)功能研究其抗肺纖維化作用的價值。 本研究的目的在于： 將Napsin A基因轉(zhuǎn)染至Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系——A549細(xì)胞,并構(gòu)建體外肺纖維化模型,研究Napsin A基因?qū)�體外肺纖維化模型的干預(yù)作用同時探討相關(guān)機制。 研究方法如下： 1.體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,予TGF-β1刺激構(gòu)建體外肺纖維化模型,TGF-β1設(shè)置5個濃度梯度,MTT法篩選出最佳濃度,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的動態(tài)變化確定建模時間。模型構(gòu)建后用RT-PCR和Western-blot方法檢測到細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白和間質(zhì)標(biāo)志蛋白的表達以鑒定模型。 2.構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒PLJM1-Napsin A,以Lipofectamine2000TM將PLJM1-Napsin A轉(zhuǎn)染給包裝細(xì)胞293T細(xì)胞,收集病毒懸液感染A549細(xì)胞,用抗生素嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定的A549-PLJM1-Napsin A細(xì)胞株,并對細(xì)胞表達目的基因和目的蛋白進行鑒定。 3.構(gòu)建體外肺纖維化模型,MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測Napsin A對A549細(xì)胞在EMT過程中增殖能力的影響,模型構(gòu)建后用RT-PCR和Western-blot方法檢測細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白和間質(zhì)標(biāo)志蛋白的表達以研究Napsin A對A549細(xì)胞EMT的干預(yù)作用。 4.構(gòu)建裸鼠A549細(xì)胞腫瘤模型,繪制瘤體生長曲線及計算抑瘤率,瘤體HE染色病理切片觀察A549細(xì)胞生長情況,體內(nèi)研究NapsinA對A549細(xì)胞增殖能力的影響。 5.Western-blot方法檢測A549細(xì)胞中整合素信號傳導(dǎo)通路的基礎(chǔ)分子—黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的表達,探討NapsinA干預(yù)A549細(xì)胞增殖和EMT的作用機制。 研究結(jié)果如下： 1.構(gòu)建體外肺纖維化模型,MTT法檢測發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞在濃度為5μg/L TGF-β1誘導(dǎo)時生長速率最大,篩選出TGF-β1最佳濃度為5μg/L;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)在TGF-β1誘導(dǎo)后第7天完全演變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞形態(tài),確定第7天為模型完成時間；模型構(gòu)建完成后,RT-PCR和Western-blot方法檢測到細(xì)胞表達E鈣蛋白明顯下調(diào),而纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原表達則顯著上調(diào)。 2.構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒PLJM1-Napsin A,選取5個單克隆行PCR鑒定,均能擴增出Napsin A mRNA條帶,大小約為1.2 kb,質(zhì)粒PLJM1-Napsin A經(jīng)自動基因測序儀測序,結(jié)果與設(shè)計序列完全符合,所含目的基因序列準(zhǔn)確無誤。RT-PCR和Western-blot方法檢測A549-PLJM1-Napsin A細(xì)胞株表達Napsin A基因和蛋白均明顯增加。 3.體外肺纖維化模型中,MTT法檢測A549-PLJM1-Napsin A細(xì)胞在EMT過程中增殖能力受到抑制,流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期；A549-PLJM1-Napsin A細(xì)胞在模型中其細(xì)胞形態(tài)間質(zhì)變、E鈣蛋白表達下調(diào)趨勢、纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原表達上調(diào)幅度均受到部分抑制,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.裸鼠A549細(xì)胞腫瘤模型成功構(gòu)建,A549-PLJM1-Napsi A細(xì)胞瘤體生長相對緩慢,抑瘤率達39.8%,瘤體HE染色病理切片觀察A549-PLJM1-Napsin A細(xì)胞胞體變圓,相對稀疏,核染色質(zhì)凝集深染。 5.Western-blot方法檢測到A549細(xì)胞在體外肺纖維化模型中表達FAK顯著增加,但轉(zhuǎn)染Napsin A基因后表達FAK增加趨勢變小 由此得出以下結(jié)論： 1.TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖和EMT,成功構(gòu)建了體外肺纖維化模型。 2.利用慢病毒載體成功構(gòu)建了A549-PLJM1-Napsin A細(xì)胞株,并且穩(wěn)定持久表達Napsin A mRNA和蛋白。 3.體內(nèi)外試驗結(jié)果提示Napsin A對細(xì)胞增殖有抑制作用。 4.體外肺纖維化模型實驗中,Napsin A可以部分抑制細(xì)胞EMT。 5.Napsin A對細(xì)胞增殖和EMT的抑制作用與下調(diào)FAK表達、抑制整合素信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R563.9
【部分圖文】：

圖1.1肺泡及肺泡壁模式圖Figure1.1Alveoliandalveolarwalldiagram3肺纖維化病理各型肺纖維化雖然起因不同，但纖維化的發(fā)展與結(jié)局基本相似，即由下癥細(xì)胞浸潤起始，逐步引起肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并伴有促泡上皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子釋放，形成成纖維細(xì)胞灶，導(dǎo)基質(zhì)蛋白和膠原沉積，最終引起肺纖維化。早期或急性期可見肺泡壁和間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞、組粒細(xì)胞及酸性粒細(xì)胞浸潤，此時肺泡腔可以不累及，但也可以有細(xì)胞落的肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)和纖維蛋白滲出，肺泡間隔內(nèi)網(wǎng)硬蛋尚未發(fā)生纖維化。隨著疾病進展，炎癥細(xì)胞滲出和浸潤減少;I型肺泡上皮細(xì)胞變性，

江蘇大學(xué)博士學(xué)位論文:NaPsinA基因治療肺纖維化的體外實驗研究及作用機釗探討病的I幾皮一lbJ質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial一mesenchymaltra，lsition，EMT)學(xué)說(圖1.2)。兒等‘’2)研究證實，在實驗性肺纖維化模型中，上皮細(xì)胞是間質(zhì)細(xì)胞的主要末源。willisBc等‘’3)研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)變成兼具膠原分與收縮功能的間質(zhì)細(xì)胞，大大加快了肺纖維化進程。

法，包括:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒及相病毒載體、疤疹病毒載體等，其中腺病毒外酶基因轉(zhuǎn)移，是目前研究較多的兩種載irus)載體屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，是基于人6cien即virustypex，Hxv一i)為基礎(chǔ)發(fā)展起來較其他傳統(tǒng)病毒載體系統(tǒng)而一言具有諸多優(yōu)，因此慢病毒及其載體的研究近年來成為的一般生物學(xué)特性逆轉(zhuǎn)錄病毒之一，為RNA病毒。慢病毒在身反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以此c過病毒整合酶作用整合到宿主細(xì)胞的染色
【參考文獻】

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本文編號：2869233