發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 22:40

　　 組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)又稱胎盤蛋白—5(placenta protein-5,PP-5)和基質(zhì)相關(guān)絲氨酸蛋白酶抑制劑(matrix associated serine protease inhibitor,MSPI),是一種帶有kunitz型結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑,屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員。成熟的人TFPI-2由富含酸性氨基酸的N端、三個(gè)串聯(lián)的kuntiz結(jié)構(gòu)域和富含堿性氨基酸的C端組成,能抑制胰蛋白酶、纖溶酶、糜蛋白酶、血漿緩激肽釋放酶、組織蛋白酶G和多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性,從而對抗多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。TFPI-2與同家族的組織因子途徑抑制物-1(TFPI-1)結(jié)構(gòu)相似,功能部分相同,也是一種重要的抗凝物質(zhì),對凝血因子Ⅶa(FⅦa)/組織因子(tissuefactor,TF)復(fù)合物、凝血因子Xa(FXa)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和尿型纖溶酶原激活物(uPA)等均有不同的抑制作用。但迄今為止,TFPI-2的生理功能尚不清楚,TFPI-2與其它蛋白質(zhì)相互作用的信息也知之有限。 我們運(yùn)用Matchmaker酵母雙雜交系統(tǒng)3,構(gòu)建了pGBKT7/TFPI-2質(zhì)粒載體。以此質(zhì)粒為誘餌,從人胎腦cDNA文庫中篩選出了95個(gè)蛋白編碼基因,包括32個(gè)代謝相關(guān)基因(其中8個(gè)參與蛋白代謝,13個(gè)參與核酸代謝,11個(gè)參與糖代謝),21個(gè)信號傳導(dǎo)相關(guān)基因,5個(gè)細(xì)胞生長與生存相關(guān)基因,7個(gè)運(yùn)輸相關(guān)基因,2個(gè)抗調(diào)亡相關(guān)基因,其余28個(gè)基因的功能不明確。通過分析相關(guān)蛋白的細(xì)胞定位、已知功能及文庫載體在雙雜交系統(tǒng)中正確表達(dá)的可能性等,進(jìn)一步確定了8個(gè)可能與TFPI-2有潛在相互作用的蛋白。 除篩選與TFPI-2相互作用的蛋白質(zhì)外,我們對TFPI-2在急性肺損傷(acutelung injury,ALI)中的作用甚感興趣。ALI是機(jī)體遭受嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、輸血、休克、酸中毒及有害氣體吸入等多種因素打擊后,出現(xiàn)彌漫性肺泡—毛細(xì)血管膜損傷,以廣泛滲出性肺水腫和微小肺不張等為病理特征的臨床綜合征。ALI病因復(fù)雜,起病急驟,發(fā)病持續(xù),存在從輕到重的連續(xù)病變過程。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)屬重癥ALI,是臨床上常見的危重性疾病。由于ALI發(fā)病機(jī)制不甚明確,迄今缺乏有效的治療策略和手段,死亡率一直居高不下,病死率高達(dá)40-60%。 急性炎癥級聯(lián)反應(yīng)是最早發(fā)現(xiàn)的ALI病理變化,貫穿于ALI始終,解釋了ALI的多種病理現(xiàn)象。近年來,凝血機(jī)制倍受關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn)ALI許多病理變化與凝血異常相關(guān),如血栓形成、纖維蛋白沉積、出血和彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等,甚至有人提出ALI特征性病理變化—透明膜的形成也與凝血異常有關(guān)。 既往研究表明,在ALI發(fā)生過程中,肺組織中許多促凝因子表達(dá)明顯升高,如組織因子(TF)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)等;而抗凝因子的表達(dá)降低或無明顯變化,如TFPI-1。但TFPI-2在ALI中的變化及作用未見報(bào)道。因此,我們觀察了TFPI-2在小鼠ALI發(fā)生和發(fā)展過程中的動(dòng)態(tài)變化及與肺組織中凝血因子和炎癥因子之間的關(guān)系。 我們采用尾靜脈注射內(nèi)毒素法成功建立了小鼠ALI動(dòng)物模型。病理形態(tài)學(xué)檢測顯示,ALI小鼠肺組織在內(nèi)毒素處理后的不同時(shí)間里,出現(xiàn)了明顯的毛細(xì)血管充血、炎性細(xì)胞侵潤、肺泡水腫、血栓形成、纖維蛋白在肺泡壁及間質(zhì)沉積、透明膜形成、肺組織實(shí)變、出血和DIC等一系列炎癥級聯(lián)和凝血異常的病理變化。我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化方法測定了ALI小鼠肺組織中的TFPI-2、TFPI-1、TF和炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)TFPI-2在ALI小鼠肺組織中明顯升高,其變化呈現(xiàn)時(shí)間依從性,在內(nèi)毒素處理后2h達(dá)到高峰,隨后逐漸下降,12h時(shí)基本恢復(fù)到初始水平。TFPI-2的動(dòng)態(tài)變化模式與重要炎癥因子IL-1β和TNF-α的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式相似,且兩兩之間呈明顯正相關(guān),TFPI-2在ALI中隨IL-1β和TNF-α的變化而變化。此外,我們發(fā)現(xiàn)TF在內(nèi)毒素處理6h后開始上升,12h達(dá)到高峰;而TFPI-1在內(nèi)毒素處理的初期即呈下降趨勢,10h時(shí)明顯低于正常水平且達(dá)到最低值,隨后逐步回升,但直到24 h仍未回到正常水平。讓人驚奇的是,ALI中TFPI-2的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式與TF和TFPI-1明顯不同,肺組織中TF/TFPI-2的摩爾比在內(nèi)毒素處理后2h和6h明顯低于對照組,表明此時(shí)TFPI-2的表達(dá)量明顯高于TF;而TF/TFPI-1的摩爾比在內(nèi)毒素處理后6h、10h和12h明顯高于對照組,提示該階段TF的促凝活性明顯強(qiáng)于TFPI-1的抗凝活性。免疫組織化學(xué)顯示,TF、TFPI-1和TFPI-2均定位于肺泡壁。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們認(rèn)為TFPI-2在ALI的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

運(yùn)用pICgK一TFpl一2為模板，用sense和Antisense引物PeR擴(kuò)增TFPx一2編碼序列，并引入EeoRI和sall兩個(gè)酶切位點(diǎn)，獲得PeR產(chǎn)物EeoRI一TFpl一2一SalI，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1一4)后純化回收產(chǎn)物片斷，回收產(chǎn)物與經(jīng)過相同酶切、凝膠電泳及純化回收的質(zhì)粒載體片斷sall一pGBKT7一EcoRI連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗生素加壓篩選轉(zhuǎn)化子;挑取克隆作模板以 T7Promote:Primer和TFPI一 2Antisense為引物作PCR，其PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1一5)，陽性克隆會PCR擴(kuò)增出產(chǎn)物T7一TFPI一2一Sall;擴(kuò)增陽性克隆菌并抽提質(zhì)粒，酶切質(zhì)粒做凝膠鑒定(圖1一6)和測序鑒定(圖1一7)，確保pGBKT7/TFPI一2質(zhì)粒成功構(gòu)建。儀協(xié)令3刃令圖1一4.瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物EcoRI一TFPI一2一Sall F191一4.Identi們 cationofPCRProductionEcoRI·TFPI·2· Sal1inl%agar gel.M:DNAmarker;1一 10:PCRProduetionEeoRI一TFPI一2一Sall(662bP).

匕 yEeoRI、今今今撇7kh瀚4kh圖1一6.質(zhì)粒的酶切鑒定Figl一6.ldenti們 cationofBaitvectorbyenzymecleavage.

哎2匡E二兮刁一乞.工OAa一0，一婦.一。比Timepe蛇LPS《h) TimePO幼LPS(h】圖2一6生理鹽水或LPS處理后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織中IL一lp和TNF一Q的加RNA水平FigZ· 6.mRNAlevelofIL一 lpandTNF· ainlungtissueatdifferenttimePointsa代 erLPSorsaline(Ctrl)treatmentbyRealtimePCR.Relative quantitiesofIL一 lp(A)andTNF一 a(B)atmRNAlevelwereexPressedasthe ratioofmRNAIeveloftargetgenetothatofp一 aetin.10mieewereexaminedin eaehgrouP， andresultswerePlottedasmeans土SE，*，P<0.05;**，P<0.01 VersusCtrl. A2500日 502500750哎之生‘左兮﹂1節(jié)15，a比一銘不繆2000 15001000500V圣‘鉀改認(rèn)1節(jié)蘭.乙-Ja^泥t比 Ctd126101224 T.mePO時(shí)L
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2893709