發(fā)布時間：2024-09-17 16:32

　　巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii syn.Pichia pastoris）作為目前重要的外源蛋白表達宿主菌之一,已經(jīng)在工業(yè)生產(chǎn)當中得到廣泛應(yīng)用。在分子生物學(xué)研究中,對于基因功能的探索是揭示生命奧秘的關(guān)鍵,如何能夠有效的探究基因的功能顯得極其重要。目前,對于該菌株發(fā)酵過程中相關(guān)基因的表達與菌株代謝規(guī)律了解甚少,特別是有關(guān)信號傳導(dǎo)通路對蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達過程中的作用。正因為缺乏對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的認知,發(fā)酵過程缺乏有效的調(diào)節(jié)與控制,外源蛋白的表達量也有待進一步的提高。基于此現(xiàn)狀,本文首先利用實驗室構(gòu)建的高表達植酸酶的畢赤酵母基因工程菌株K.phaffii GS115/pPIC9K-PhyA為出發(fā)菌株,在10,000 L發(fā)酵罐進行了發(fā)酵研究,利用RNA-Seq技術(shù)分別對菌株在批量發(fā)酵階段、甘油流加階段、甘油-甲醇混合進料階段以及在甲醇誘導(dǎo)階段的不同時期進行基因表達的研究:結(jié)果表明顯著上調(diào)的基因數(shù)主要發(fā)生在促分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）信號通路、過氧化物酶體、甲醇代謝、淀粉和蔗糖代謝、自噬、線粒體吞噬和減...

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
術(shù)語及符號說明
第1章 緒論
    1.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)
        1.1.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀
        1.1.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點及不足
    1.2 利用RNA-Seq技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
        1.2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)基本概述
        1.2.2 轉(zhuǎn)錄組在畢赤酵母中的研究進展
    1.3 CRISPR技術(shù)及發(fā)展
        1.3.1 CRISPR技術(shù)的基本原理
        1.3.2 Cas9 蛋白和sgRNA
    1.4 MAPK信號通路
        1.4.1 激酶:一種細胞信號傳遞機制
        1.4.2 MAPK激酶級聯(lián)反應(yīng)
        1.4.3 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
    1.5 本課題的研究背景及意義
    1.6 研究內(nèi)容
    1.7 技術(shù)路線
第2章 高表達植酸酶畢赤酵母GS115的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 常用溶液和常用培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配置
    2.2 實驗方法
        2.2.1 發(fā)酵過程及條件
        2.2.2 RNA-Seq樣品制備
        2.2.3 RNA定量和鑒定
        2.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序的文庫制備
        2.2.5 質(zhì)量控制
        2.2.6 Read映射到參考基因組
        2.2.7 差異表達分析
        2.2.8 差異表達基因的KEGG富集分析
        2.2.9 酶活測定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 補料分批發(fā)酵系統(tǒng)探討誘導(dǎo)巴斯德畢赤酵母植酸酶的異源表達
        2.3.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)總體分析
        2.3.3 畢赤酵母代謝途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第3章 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在畢赤酵母中的構(gòu)建及研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗菌株及質(zhì)粒
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 常用培養(yǎng)基
        3.1.5 引物合成,基因測序及基因合成
    3.2 實驗方法
        3.2.1 熒光蛋白mCherry報告系統(tǒng)的建立
            3.2.1.1 熒光蛋白mCherry真核表達載體的構(gòu)建
            3.2.1.2 重組熒光蛋白mCherry在畢赤酵母中的高效表達
            3.2.1.3 重組熒光蛋白mCherry的熒光檢測
        3.2.2 畢赤酵母基因編輯系統(tǒng)pGAP-spCas9-sgRNA的構(gòu)建及應(yīng)用
        3.2.3 畢赤酵母基因編輯系統(tǒng)pHTX-hsCas9-sgRNA-Z的構(gòu)建及應(yīng)用
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 熒光蛋白m Cherry報告系統(tǒng)的建立
        3.3.2 畢赤酵母基因編輯系統(tǒng)pGAP-spCas9-sgRNA的構(gòu)建及應(yīng)用
        3.3.3 畢赤酵母基因編輯系統(tǒng)pHTX-hsCas9-sgRNA-Z及應(yīng)用
    3.4 討論
    3.5 本章小節(jié)
第4章 畢赤酵母MAPK通路上調(diào)基因的缺失及表型研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗菌株及質(zhì)粒
        4.1.2 主要儀器
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 常用培養(yǎng)基
        4.1.5 引物合成及基因測序
    4.2 實驗方法
        4.2.1 畢赤酵母MAPK通路上調(diào)基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.2 畢赤酵母感受態(tài)細胞GS115的制備及轉(zhuǎn)化
        4.2.3 畢赤酵母基因組的提取
        4.2.4 基因敲除結(jié)果的驗證
        4.2.5 植酸酶的測定
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 畢赤酵母MAPK通路上調(diào)基因分析
        4.3.2 畢赤酵母MAPK通路上調(diào)基因敲除靶點的選擇及敲除質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.3 畢赤酵母MAPK通路上調(diào)基因缺失菌株的構(gòu)建
        4.3.4 基因敲除菌株的生長曲線
        4.3.5 基因敲除菌株在PAOX1調(diào)控下植酸酶的表達情況
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
第5章 總結(jié)與展望
    5.1 總結(jié)
        5.1.1 高表達植酸酶畢赤酵母的轉(zhuǎn)錄組分析
        5.1.2 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在畢赤酵母中的構(gòu)建及研究
        5.1.3 畢赤酵母MAPK通路上調(diào)基因的缺失及表型研究
    5.2 創(chuàng)新
    5.3 展望
致謝
參考文獻
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和研究成果
附錄
    附錄 A 實驗中所使用的緩沖液的配制
    附錄 B 本文所涉及到的氨基酸序列
    附錄 C 本文所涉及到的核苷酸序列
    附錄 D 氨基酸中英文對照及縮寫表



本文編號：4005728