發(fā)布時(shí)間：2018-01-06 00:16

  本文關(guān)鍵詞：包裹溶瘤腺病毒的微顆粒和6氨基煙酰胺在腫瘤治療中的作用　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:溶瘤腺病毒(OA)是一種經(jīng)過(guò)基因改造的病毒,直徑在80-100nm左右,是目前腫瘤生物療法的手段之一。病毒本身的免疫原性、腫瘤細(xì)胞下調(diào)受體表達(dá)等會(huì)導(dǎo)致溶瘤腺病毒殺傷腫瘤能力下降,這限制了它在臨床上的廣泛運(yùn)用。微顆粒是外界刺激比如紫外,高溫等導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過(guò)程中產(chǎn)生的囊泡結(jié)構(gòu)。在外部刺激下,細(xì)胞骨架發(fā)生改變,使得細(xì)胞質(zhì)中的組分被細(xì)胞膜包裹,形成直徑約100-1OOOnm的囊泡。這些囊泡分泌到細(xì)胞外,就成為微顆粒(MP)。已有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞來(lái)源的微顆粒不僅可以作為疫苗用于預(yù)防和治療腫瘤,也可以作為納米材料包裹化療藥物對(duì)腫瘤進(jìn)行殺傷。本部分工作嘗試探討微顆粒包裹溶瘤腺病毒(OA-MPs)的可行性及其存在的優(yōu)勢(shì),并對(duì)微顆粒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。方法:(1)為研究MP是否能包裹OA,我們借助透射電子顯微鏡觀察OA-MP中OA與MP的相對(duì)位置關(guān)系。為明確單個(gè)MP中包裹OA的數(shù)量,提取OA-MPs和OA的全基因組DNA后用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析。(2)為檢測(cè)OA-MPs是否具有生物學(xué)活性,我們分別將MPs、OA-MPs、OA與A549細(xì)胞中共孵育,借助Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)OA相關(guān)蛋白Hexon、Fiber和E1A的表達(dá)情況。(3)為比較OA-MPs、OA、MPs的腫瘤殺傷能力,將三者分別與A549腫瘤細(xì)胞共孵育,48小時(shí)后用顯微鏡觀測(cè)A549腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。為研究不同細(xì)胞來(lái)源的MP所包裹的OA對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響,利用三種不同細(xì)胞(A549、HEK293、K562)來(lái)源的MP來(lái)包裹病毒,然后將所得的OA-MPs與A549腫瘤細(xì)胞共孵育,并用流式細(xì)胞儀來(lái)分析腫瘤細(xì)胞的凋亡率。(4)為研究OA-MPs對(duì)小鼠肝腎功能的影響,我們將PBS、MPs、OA、OA-MPs分別注射于小鼠腹腔,連續(xù)注射五日后,借助試劑盒分析小鼠眼球血中ALT和CRE的含量。為研究OA-MPs對(duì)正常細(xì)胞的影響,將PKH26標(biāo)記的OA-MPs與正常志愿者血液中的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)共孵育,分別于6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定PBMC中PKH26的熒光表達(dá)。將OA-MPs、OA、MPs分別與PBMC共孵育12小時(shí),用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)PBMC的凋亡率。(5)為研究OA-MPs在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況,將OA-MPs和OA分別與A549細(xì)胞共同培養(yǎng),于不同時(shí)間點(diǎn)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定胞內(nèi)病毒的滴度。為研究OA-MPs在腫瘤組織的藥效動(dòng)力學(xué)特征,將OA-MPs注射于裸鼠的腫瘤部位,于6h、12h、24h、36h、72h、96h時(shí)間點(diǎn)取出腫瘤,用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析腫瘤內(nèi)部病毒DNA的滴度。(6)用流式分析不同干擾因素(肝素、溫度、MP尺寸、EDTA、胰蛋白酶、pH)對(duì)腫瘤細(xì)胞吞噬微顆粒效率的影響。(7)用激光共聚焦顯微鏡觀察微顆粒膜與腫瘤細(xì)胞膜之間相對(duì)位置關(guān)系。(8)借助分子動(dòng)力學(xué)模擬探討微顆粒進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制。結(jié)果:(1)在電鏡下面直接觀測(cè)到MP中包裹的OA。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示每MP攜帶約5個(gè)OA。(2)OA-MPs和OA 一樣,均可在A549細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Hexon、Fiber和E1A三種蛋白,但MP組和control組未見(jiàn)這三種蛋白的表達(dá)。(3)A549細(xì)胞與OA-MPs共孵育后,細(xì)胞處于半懸浮的狀態(tài),變圓,狀態(tài)最差;與OA共孵育后,細(xì)胞貼壁,狀態(tài)欠佳;而對(duì)照組以及MP組中,細(xì)胞狀態(tài)良好。流式結(jié)果顯示不同細(xì)胞A549、HEK293、K562產(chǎn)生的OA-MPs使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡率分別為31%、29%、22%。(4)MPs、OA、OA-MPs各組小鼠血液中的ALT與PBS對(duì)照組相近,約為13U/L;CRE也與PBS對(duì)照組相近,約為18 umol/L。PBMC與OA-MPs共孵育 6h、12h、24h 后分別吞噬 50%、59%、63%的 OA-MPs。PBMC 與 OA-MPs、OA、MPs、PBS分別共孵育12h后PBMC的凋亡率分別為18.3%、21.4%、24.3%、19.2%,說(shuō)明OA-MPs對(duì)正常的PBMC細(xì)胞無(wú)任何影響。(5)OA-MPs和OA分別與A549細(xì)胞共同培養(yǎng),實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示不同時(shí)間點(diǎn)OA-MPs組的A549細(xì)胞內(nèi)病毒滴度都明顯高于OA組。OA-MPs注射于裸鼠腫瘤部位,實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示腫瘤內(nèi)部OA在注射36小時(shí)病毒載量達(dá)到最高值。(6)4℃共孵育2h和4h,腫瘤細(xì)胞攝取微顆粒分別為20.2%和28.1%;37℃共孵育2h和4h,腫瘤細(xì)胞攝取微顆粒分別為87.6%和92.3%。PBS處理的腫瘤細(xì)胞與胰蛋白酶處理的腫瘤細(xì)胞對(duì)微顆粒的攝取在2h時(shí)分別為85.6%和18.1%;在4h時(shí),分別為94.8%和28.4%。在OuM、100uM、500uM、1000uM EDTA濃度下,腫瘤細(xì)胞攝取微顆粒的效率分別為88.4%、83.7%、47.2%、40.4%。pH 值為 6.4、6.8、7.2、7.5、8.0、8.5、9.0 時(shí),腫瘤細(xì)胞攝取微顆粒分別為 76.4%、76.2%、71.5%、64.8%、65.4%、14.8%、5.93%。微顆粒尺寸在100-220nm,220nm-600nm,600-1000nm三個(gè)不同范圍內(nèi),腫瘤細(xì)胞攝取微顆粒分別為63.1%、21.6%和14.2%。當(dāng)加入肝素的濃度為0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml時(shí),腫瘤細(xì)胞攝取微顆粒分別為95%、37.2%、36.1%、35%和32.5%。(7)腫瘤細(xì)胞膜用PKH26標(biāo)記為紅色,微顆粒用PKH67標(biāo)記為綠色,共孵育20min后,激光共聚焦顯示微顆粒的綠色熒光出現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞膜處和腫瘤細(xì)胞內(nèi)部。腫瘤細(xì)胞膜不作標(biāo)記,微顆粒用PKH67標(biāo)記為綠色,激光共聚焦顯示6h后多數(shù)微顆粒所攜帶的綠色進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,少數(shù)微顆粒所攜帶的綠色標(biāo)記于腫瘤細(xì)胞膜。當(dāng)把PKH67標(biāo)記的綠色微顆粒,紅色標(biāo)記的葡聚糖以及腫瘤細(xì)胞三者共孵育,激光共聚焦結(jié)果顯示微顆粒的綠色熒光分布于腫瘤細(xì)胞表面或內(nèi)部,葡聚糖的紅色熒光分布于腫瘤細(xì)胞內(nèi)部,兩者無(wú)重合現(xiàn)象。(8)分子模擬結(jié)果顯示,含有脂筏結(jié)構(gòu)的囊泡可以在1.0μs內(nèi)與細(xì)胞完成融合。且隨著細(xì)胞或者微顆粒尺寸的增加,融合過(guò)程的發(fā)生愈加困難。當(dāng)細(xì)胞的尺寸增大至接近水平面時(shí)(曲率較小),微顆�？赡芡ㄟ^(guò)穿孔過(guò)程直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。結(jié)論:微顆粒能包裹溶瘤腺病毒形成OA-MPs。這種新型合成的OA-MPs較傳統(tǒng)的裸露OA病毒存在著以下的優(yōu)勢(shì):一,OA-MPs具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷能力,且對(duì)正常的細(xì)胞無(wú)任何毒副作用。二,OA-MPs中的病毒可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)更高效地進(jìn)行復(fù)制。三,OA-MPs可能通過(guò)融合或穿孔過(guò)程將OA釋放至腫瘤細(xì)胞內(nèi)部,不依賴細(xì)胞表面的CAR受體。OA-MPs的上述研究結(jié)果顯示OA-MPs在腫瘤的治療中能發(fā)揮較好的抗癌效果,具有潛在的臨床運(yùn)用價(jià)值。目的:6氨基煙酰胺(6-Aminonicotinamide,6AN)被代謝為6-氨基-NAD(P +)后能競(jìng)爭(zhēng)性抑制磷酸戊糖途徑中6磷酸葡萄糖脫氫酶的活性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的升高。6AN能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療敏感性,可作為放化療的輔助用藥運(yùn)用于腫瘤的治療中。近年來(lái),腫瘤的免疫治療一直是研究的熱點(diǎn),腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophage,TAM)更是受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。研究表明,ROS作為信號(hào)分子,對(duì)巨噬細(xì)胞的表型起著重要的調(diào)節(jié)作用。本文主要探討6AN介導(dǎo)的ROS升高活化巨噬細(xì)胞的可行性,并嘗試闡述所涉及的信號(hào)通路,以說(shuō)明6AN在腫瘤治療中的作用。方法:(1)為研究6AN是否能活化巨噬細(xì)胞,6AN處理M0型巨噬細(xì)胞,PBS處理為對(duì)照組,借助倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,用流式分析細(xì)胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ和細(xì)胞內(nèi)因子IL-12、IFN-γ的表達(dá)情況。為研究6AN是否活化腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞,用6AN連續(xù)七天腹腔注射治療小鼠體內(nèi)的腫瘤,并于第八天從腹腔分離出腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(TAM),流式分析TAM的細(xì)胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ和細(xì)胞內(nèi)因子IL-12、IFN-γ的表達(dá)情況。(2)為研究6AN活化巨噬細(xì)胞的機(jī)制,6AN處理巨噬細(xì)胞,借助酶標(biāo)儀分析細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG的含量,用流式分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化,用Western Blot檢測(cè)AKT/MAPK通路信號(hào)蛋白的磷酸化水平,用免疫熒光技術(shù)分析轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是否入核。清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞后進(jìn)一步驗(yàn)證6AN的腫瘤治療作用與巨噬細(xì)胞的關(guān)系。(3)為研究6AN對(duì)腫瘤干細(xì)胞的影響,在體外,我們用6AN處理3D環(huán)境中培養(yǎng)出的腫瘤干性樣細(xì)胞(TRC),并分析TRC細(xì)胞的克隆數(shù)目、面積的變化。在體內(nèi),用6AN治療腹水小鼠,分離出腹腔的H22細(xì)胞,并將H22培養(yǎng)在3D中,觀察H22細(xì)胞克隆數(shù)目、面積改變。(4)為研究6AN對(duì)腫瘤殺傷的普適性,用6AN治療不同的腫瘤小鼠如H22肝癌,CMT93結(jié)腸癌,B16F1黑色素瘤,觀察小鼠生存期,測(cè)量腫瘤的大小。(5)為研究在小鼠體內(nèi)6AN對(duì)順鉑的增敏作用,將6AN和順鉑聯(lián)合運(yùn)用治療不同小鼠腫瘤模型(H22肝癌模型,CMT93結(jié)腸癌模型,B16F1黑色素瘤模型),觀察小鼠生存期,測(cè)量腫瘤大小。結(jié)果:(1)體外,6AN處理M0型巨噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞由菱形扁平狀變?yōu)殚L(zhǎng)梭狀,兩邊伸出明顯的枝角。PBS處理組和6AN處理組的巨噬細(xì)胞表面分子CD80的表達(dá)率分別為48.8%和91.1%;CD86的表達(dá)率分別為16.1%和56.1%;MHCⅡ的表達(dá)率分別為36.7%和71.5%。PBS處理組和6AN處理組的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)因子IFN-γ的表達(dá)率分別為1.17%和5.01%;IL-12的表達(dá)率分別為0.93%和3.02%。體內(nèi),6AN治療腫瘤小鼠八天后,結(jié)果顯示對(duì)照組和6AN處理組的腹腔腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞表面分子CD80的表達(dá)率分別為11.5%和23.1%;CD86的表達(dá)率分別為5.96%和32.0%;MHCⅡ的表達(dá)率分別為4.56%和10.2%。對(duì)照組和6AN處理組的腹腔腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)因子IFN-y的表達(dá)率分別為70.6%和85.2%;IL-12的表達(dá)率分別為9.08%和35.4%(2)6AN處理M0巨噬細(xì)胞,細(xì)胞胞內(nèi)GSH/GSSG的水平僅僅是對(duì)照組的三分之一,ROS水平約是對(duì)照組的五倍。Western Blot分析顯示6AN能夠在30min、1h、2h、6h、8h時(shí)間點(diǎn)上調(diào)AKT蛋白和ERK蛋白的磷酸化水平,其中尤以30min時(shí)刻最為顯著。JNK蛋白的磷酸化水平在30min和1h時(shí)刻上調(diào),P38的蛋白磷酸化水平在30min時(shí)刻上調(diào)。激光共聚焦結(jié)果顯示6AN處理后NF-κB所攜帶的紅色熒光與細(xì)胞核所帶的藍(lán)色熒光重合,而對(duì)照組的細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)任何紅色熒光。6AN治療的小鼠腫瘤體積、重量比PBS或者清除巨噬細(xì)胞后用6AN治療組的低。(3)在體外,PBS處理組的TRC細(xì)胞克隆面積約為6AN處理組的三倍,克隆數(shù)目約為6AN處理組的兩倍。在體內(nèi),PBS處理組的TRC細(xì)胞克隆面積和克隆數(shù)目均約為6AN處理組的兩倍。(4)6AN對(duì)不同腫瘤模型小鼠均有較好的治療效果。經(jīng)6AN治療后,肝癌小鼠和結(jié)腸癌小鼠的生存期明顯延長(zhǎng),皮膚癌小鼠的腫瘤體積明顯減小,瘤重減輕。(5)6AN-順鉑聯(lián)合治療組肺部黑色素瘤數(shù)量少于順鉑治療組;6AN-順鉑聯(lián)合治療組的肝癌患鼠和結(jié)腸癌患鼠生存時(shí)間長(zhǎng)于順鉑治療組。結(jié)論:6AN能夠通過(guò)ROS/AKT/MAPK/NF-κB信號(hào)通路使巨噬細(xì)胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ和細(xì)胞內(nèi)因子IL-12、IFN-γ表達(dá)上調(diào),從而活化巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞朝向M1方向分化,最終介導(dǎo)腫瘤的免疫治療。6AN也能抑制腫瘤干性細(xì)胞的生長(zhǎng)和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑治療的敏感性。上述研究表明6AN在腫瘤的治療中除了可以作為順鉑增敏劑和腫瘤干細(xì)胞抑制劑,也可以作為人體免疫系統(tǒng)的調(diào)控藥物,具有潛在的臨床運(yùn)用價(jià)值。
[Abstract]:Objective: oncolytic adenovirus (OA) is a genetically engineered virus, about 80-100nm in diameter, is one of the tumor biological therapy method at present. The immunogenicity of the virus itself, tumor cells can lead to down-regulation of receptor expression of oncolytic adenovirus tumor killing ability decreased, which limits its wide application in clinic.. micro particles is outside stimuli such as ultraviolet, process of cell apoptosis caused by high temperature in the vesicle structure. Under external stimuli, cytoskeleton changes, the cytoplasmic components in the cell membrane is wrapped, forming a diameter of about 100-1OOOnm vesicles. These vesicles secreted outside the cells to become micro the particles (MP). It has been found that micro particles from tumor cells not only can be used as a vaccine for the prevention and treatment of tumors, but also can be used as a nano material coated chemotherapy drugs on tumor cells. This part of work to try To investigate the micro particles of oncolytic adenovirus (OA-MPs) and the feasibility and advantage exists, explored the mechanism into tumor cells of micro granules. Methods: (1) to investigate whether MP can package OA, we use transmission electron microscope observation of OA and MP OA-MP in the relative position. As the number of clear a single MP package OA, real time quantitative PCR analysis method for genomic DNA extraction of OA-MPs and OA. (2) to detect whether OA-MPs has biological activity, we were MPs, OA-MPs, OA and A549 cells were incubated with the Western, Blot detection of intracellular OA related protein expression of Fiber and Hexon. E1A. (3) as compared to OA-MPs, OA, MPs tumor killing ability, three were with A549 tumor cells were incubated for 48 hours, after A549 with microscope observation the morphology of tumor cells. To study the effect of different cell derived MP wrapped by OA on tumor cells 鑳?yōu)鐨勫奖鍝?鍒╃敤涓夌�嶄笉鍚尵l嗚優(yōu)(A549,HEK293,K562)鏉ユ簮鐨凪P鏉ュ寘瑁圭梾姣，

本文編號(hào)：1385475