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《南京中醫(yī)藥大學》 2015年

從線粒體途徑研究川芎嗪誘導HepG2細胞凋亡效應機制

馮全服  

【摘要】：惡性腫瘤是人類健康面臨的重大問題之一。目前放療、化療等治療方法仍然存在副作用大、耐藥等問題。因此,尋找防治腫瘤有效藥物成為當務之急。川芎嗪(Tetramethylpyrazine, TMP)具有多種藥理活性,如抗氧化、改善微循環(huán)及抗腫瘤等。近年來,川芎嗪抗腫瘤作用日益受到關(guān)注,但圍繞川芎嗪誘導腫瘤細胞凋亡機制需進一步探索。線粒體是細胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用的細胞器。線粒體途徑凋亡(Mitochondrial pathway of apoptosis)主要是線粒體上游信號分子啟動后作用于線粒體膜,線粒體膜的功能狀態(tài)改變引起B(yǎng)cl-2蛋白家族活化,線粒體PT孔(Permeability transition pore, PT)打開,色素細胞c (Cytochrome c, Cyt-c)啟動釋放,引起含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)蛋白家族活化,促使細胞凋亡。目的通過Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法檢測腫瘤細胞增殖抑制并篩選靶腫瘤細胞株。探討川芎嗪誘導細胞凋亡量效關(guān)系、時效關(guān)系以及影響線粒體相關(guān)蛋白表達及功能變化。重點研究川芎嗪對HepG2細胞凋亡、線粒體功能及相關(guān)蛋白表達的影響,探討川芎嗪抑制HepG2細胞增殖的分子機制,探索從線粒體途徑揭示川芎嗪誘導HepG2細胞凋亡效應機制。方法采用CCK-8法觀察川芎嗪對HepG2、A549、SMMC-7721、MCF-7、 MCF-10A、L-O2、及BEAS-2B細胞增殖抑制作用。通過IC50及靶向作用效果篩選出HepG2細胞,并觀察川芎嗪抑制HepG2增殖作用及量效關(guān)系。通過實時細胞分析技術(shù)觀察川芎嗪對HepG2細胞增殖抑制能力的影響。流式細胞技術(shù)觀察川芎嗪對HepG2細胞凋亡及細胞周期的影響。通過全自動蛋白系統(tǒng),觀察川芎嗪對HepG2細胞P53蛋白以及Bcl-2/Bax蛋白表達的影響。高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察川芎嗪對HepG2細胞Cyt-c的釋放以及線粒體跨膜電位的影響；通過全自動蛋白分析系統(tǒng),觀察川芎嗪對HepG2細胞cleaved-Caspase-3及cleaved-Caspase-9的蛋白表達的影響,以期探討川芎嗪誘導HepG2凋亡效應機制。結(jié)果1.川芎嗪抑制HepG2細胞增殖。10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、 100μg/mL、200μg/mL及400μg/mL組抑制率與對照組比較有顯著性差異(P0.01),且400μg/mL及400μg/mL組抑制率高于陽性藥組。川芎嗪干預HepG2細胞12、24和48h后均能顯著抑制HepG2細胞的增殖(P0.01)。川芎嗪干預HepG2細胞后能顯著降低細胞核大小(P0.05),顯著增加Annexin V-FITC (P0.01)和PI(P0.01)熒光值。川芎嗪能顯著誘導HepG2細胞凋亡,呈量效、時效相關(guān)。2.川芎嗪顯著影響HepG2細胞周期。100 μg/mL川芎嗪干預HepG2細胞12h后,能顯著增加HepG2細胞處于G0/G1期的數(shù)量(P0.01)。100μg/mL川芎嗪干預HepG2細胞24h和48h后,HepG2細胞凋亡數(shù)量顯著增加(P0.01)。3.川芎嗪顯著增加Cyt-c轉(zhuǎn)位(P0.01)；顯著降低線粒體膜電位(P0.05)。顯著增加cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白的表達(P0.01)。100μg/mL川芎嗪干預HepG2細胞使得p53蛋白的表達顯著上升(P0.01)。100 μg/mL川芎嗪干預HepG2細胞使得Bcl-2/Bax蛋白表達比率顯著下降(P0.01)。結(jié)論1.川芎嗪對HepG2、A549、SMMC-7721及MCF-7等腫瘤細胞細胞增殖有抑制作用。2.川芎嗪對HepG2增殖抑制呈劑量依賴性和時間依賴性,IC50劑量低,抑制作用顯著。3.川芎嗪干預HepG2細胞12h主要誘導細胞G0/G1期阻滯；作用24h和48h后能夠顯著誘導HepG2細胞凋亡。4.川芎嗪能夠顯著增加p53蛋白表達、降低Bcl-2/Bax表達比率,促發(fā)線粒體膜電位降低,顯著增加Cyt-c轉(zhuǎn)位,從而增加cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達,表明川芎嗪通過Caspase依賴性線粒體介導的細胞凋亡途徑抑制HepG2細胞增殖。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

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