發(fā)布時間：2020-11-10 17:12

　　 胎盤是妊娠過程中形成的一個獨特且高度動態(tài)變化的臨時器官,對孕產(chǎn)婦及胎兒的健康至關(guān)重要。DNA甲基化作為經(jīng)典的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式,其在胎盤發(fā)育及滋養(yǎng)細胞合體化中的作用,以及這種調(diào)控異常是否參與子癇前期的發(fā)生,目前均不清楚。本研究綜合利用人原代滋養(yǎng)細胞(Human primary trophoblast,PHT)、細胞系及臨床樣本,采用免疫組織化學(xué)、Western Blot、免疫熒光、生物信息學(xué)分析等技術(shù),明確5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)1、3A、3B在人正常胎盤及子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞中的表達模式;闡明DNMT1、3A、3B在滋養(yǎng)細胞合體化過程中的作用;篩選合體化前后潛在受甲基化調(diào)控的差異表達基因;最后探明DNMTs與CREB信號通路的相互關(guān)系。獲得的研究結(jié)果如下:一、滋養(yǎng)細胞中DNMTs的表達模式和甲基化水平利用人早孕絨毛組織、人絨毛合體滋養(yǎng)層重建模型、原代滋養(yǎng)細胞體外自發(fā)合體化模型及BeWo細胞系體外誘導(dǎo)合體化模型,通過免疫組織化學(xué)、免疫熒光、Western Blot等技術(shù),研究DNMTs在滋養(yǎng)細胞中的表達模式,結(jié)果顯示:DNMTs及5mC在早孕絨毛組織中均高表達于細胞滋養(yǎng)細胞層,少量表達于合體滋養(yǎng)細胞層,在新發(fā)合體滋養(yǎng)細胞層亦表達較低;在原代滋養(yǎng)細胞體外自發(fā)合體化及BeWo細胞系誘導(dǎo)合體化過程中均伴隨DNMTs的降低表達。二、DNMTs在滋養(yǎng)細胞合體化過程中的作用采用細胞免疫熒光、Western Blot等技術(shù),探究DNMTs差異表達對BeWo細胞系合體化的影響,結(jié)果顯示:DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza抑制DNMTs的表達,BeWo細胞合體化增強;過表達DNMTs后BeWo細胞合體化受到阻礙。在原代滋養(yǎng)細胞體外自發(fā)合體化過程中利用cAMP/PKA/CREB信號通路抑制劑H89處理及BeWo細胞系5-aza誘導(dǎo)去甲基化模型中探究DNMTs與CREB信號通路的相互關(guān)系。Western Blot結(jié)果顯示H89能夠顯著抑制原代滋養(yǎng)細胞體外自發(fā)合體化過程中CREB磷酸化及合體化標(biāo)志物蛋白水平的表達,但因自發(fā)合體化引起的DNMTs的下調(diào)未能恢復(fù);5-aza可誘導(dǎo)BeWo細胞系中DNMTs蛋白表達降低、磷酸化CREB蛋白表達升高。三、篩選合體化前后潛在受甲基化調(diào)控的差異表達基因基于原代滋養(yǎng)細胞體外自發(fā)合體化前后的甲基化芯片測序數(shù)據(jù)及GEO網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫,運用GO和KEGG聚類方法篩選出合體化前后去甲基化并且上調(diào)表達的差異基因,并利用熒光定量PCR、Western Blot、免疫組織化學(xué)等技術(shù)對差異基因驗證。篩選出59個在合體化過程中去甲基化并且上調(diào)表達的目標(biāo)基因,并進一步在BeWo細胞去甲基化模型中證實甲基化水平升高、轉(zhuǎn)錄組表達降低的調(diào)控模式,初步篩選出合體化過程中受甲基化調(diào)控的靶標(biāo)因子Wnt7a。四、PE胎盤滋養(yǎng)細胞中DNMTs的表達模式和甲基化水平利用對照個體及PE足月胎盤組織以及分離的原代滋養(yǎng)細胞體外自發(fā)合體化模型,采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光、Western Blot等技術(shù),研究DNMTs在PE滋養(yǎng)細胞中的表達,結(jié)果顯示:PE胎盤組織中合體滋養(yǎng)細胞減少,DNMTs及5mC表達水平均高于正常胎盤組織;PE胎盤原代滋養(yǎng)細胞體外自發(fā)合體化能力降低。綜合以上結(jié)果,我們認(rèn)為,在滋養(yǎng)細胞合體化過程中DNMTs下調(diào)表達,甲基化水平降低;DNA甲基化可能通過調(diào)控CREB信號通路磷酸化激活參與調(diào)控合體化過程;Wnt7a是在合體化過程中受甲基化調(diào)控的靶標(biāo)因子;DNMTs異常表達影響PE胎盤中滋養(yǎng)細胞的合體化進程,可能與PE發(fā)生相關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R714
【部分圖文】：

組之間的差異，且 P 值<0.05 具有統(tǒng)計學(xué)差異。每個實驗至少包括三組樣品重復(fù)。2 結(jié)果2.1 早孕絨毛組織中 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的表達模式和甲基化水平免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示（圖 1A），在 6-8 周的早孕胎盤絨毛組織中，CK7 標(biāo)記絨毛組織的細胞滋養(yǎng)細胞（CTB），CTB 的外側(cè)為合體滋養(yǎng)細胞（STB），通過連續(xù)切片可以看出，DNMT1、3A、3B 和 5mC 在 CTB 層的表達都明顯高于 STB層，提示 CTB 中的甲基化水平高于 STB。合體滋養(yǎng)層重建結(jié)果顯示（圖 1B），新發(fā) STB 層 DNMT1、3A、3B 和 5mC 的表達在 STB 層均顯著低于 CTB 層，提示 CTB 向 STB 分化過程中 DNMTs 下調(diào)表達，甲基化水平可能降低。

細胞核聚集、合胞體增多，融合效率達 67%（圖 2B），且 DNMT1、3A、3B 和 5mC 均下調(diào)表達（圖2C）。Westernblot 印跡分析結(jié)果顯示，48h 后合體化標(biāo)志物 Syncytin-1、GCM1、β-HCG 蛋白水平升高，DNMTs 蛋白表達降低，表明在 48h 體外自發(fā)合體化后伴隨 DNMTs 表達降低（圖 2D）。接著在 BeWo 細胞系中建立合體化模型，利用cAMP 信號通路激活劑 FSK 以及 8-Br-cAMP 誘導(dǎo)細胞合體化[5,18]，72h 后，免疫熒光標(biāo)記 E-cadherin，在誘導(dǎo)組均表達降低且出現(xiàn)細胞核聚集成簇現(xiàn)象（圖 2E）

圖 3 DNMTs 差異表達對 BeWo 細胞合體化的影響Figure 3 The Effect of differential expressed DNMTs on the fusion of BeWo cellsA. Immunofluorescence detecting cell fusion after 5-aza treatment; B. Immunofluorescencedetection of co-localization of E-cad with 5mC, DNMT1, 3Aand 3B following 5-azatreatment in BeWo cells; C. Western blot analysis of DNMTs and syncytiotrophoblastmakers proteins expression under 5-aza treatment in BeWo cells; D. Western blot analysis ofDNMTs and syncytiotrophoblast makers expression after overexpression of DNMT1, 3A, 3Bcombined with fusion induction in BeWo cells; E. Immunofluorescence detection of cellfusion under forced expression of DNMT1, 3A, 3B combined with Forskolin treatment. Scalebar 50μm; F. qRT-PCR detection mRNAlevel of DNMTs and syncytiotrophoblast makers inForskolin treatment BeWo cells with forced expression of DNMT1, 3A, 3B.2.4 DNMTs 參與調(diào)控 CREB 信號通路
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本文編號：2878156